顧檢波,王 秀,李 艷

(1.江蘇省常熟市支塘人民醫(yī)院，江蘇 常州 215500； 2.皖南醫(yī)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002；3.皖南醫(yī)學(xué)院附屬戈磯山醫(yī)院，安徽 蕪湖 241001)

肺癌是人類最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，早期患者大多無(wú)明顯臨床癥狀，70%以上出現(xiàn)癥狀就診的患者已屬疾病晚期，致使肺癌患者5年生存率低[1，2]。對(duì)于肺癌患者，化療和放療是主要的治療手段，但相應(yīng)治療也會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生極大的副作用，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。目前，增效減毒已成為腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)，中醫(yī)藥在此方面發(fā)揮著重要獨(dú)特的作用。

“扶正祛邪”法是中醫(yī)治療疾病的常用方法，本文所用的扶正祛邪抗癌方為國(guó)醫(yī)大師李濟(jì)仁教授及李艷主任醫(yī)師治療晚期肺癌臨床醫(yī)案及相關(guān)用藥經(jīng)驗(yàn)中精簡(jiǎn)化裁出的經(jīng)驗(yàn)方，在前期的臨床觀察中取得了較好的療效?！皳駮r(shí)服用”是李濟(jì)仁教授傳承自新安醫(yī)學(xué)的獨(dú)特經(jīng)驗(yàn)，為觀察扶正祛邪抗癌方選擇不同時(shí)間給藥的治療效果。本實(shí)驗(yàn)在lewis肺癌荷瘤小鼠模型上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，觀察該方對(duì)小鼠化療造血功能的影響以及擇時(shí)用藥對(duì)機(jī)體造血水平的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及瘤株

SPF級(jí)雄性C57BL/6近交小鼠60只，4～6周齡，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)于南京青龍山實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供(合格證號(hào)SCXK(蘇)2012～0004)。Lewis肺癌瘤株種鼠由皖南醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)藥物及試劑

中藥扶正祛邪抗癌方由黃芪、當(dāng)歸、黨參、石見(jiàn)穿、白花蛇舌草按7∶3∶3∶2∶2組成，購(gòu)置于皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院藥房。采用浸泡、煮沸、水浴濃縮等方法制備，生藥含量為1 g/ml，按常人劑量(10 g/60 kg)灌服。P4394-順鉑由上海前塵生物科技有限公司提供，用生理鹽水配置成濃度為0.25 mg/ml的溶液待用。粒細(xì)胞集落刺激因子、促紅細(xì)胞生成素含量采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)，試劑盒由武漢貝茵萊生物科技有限公司提供。ELx800全自動(dòng)酶聯(lián)儀購(gòu)自美國(guó)寶特儀器有限公司。

1.3 造模及分組

雄性C57BL/6近交小鼠60只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行造模。方法為取傳代14 d的荷Lewis肺癌C57BL/6小鼠，脫頸椎處死，放入75%酒精中浸泡消毒10 min，在無(wú)菌條件下剝?nèi)∧[瘤組織，剔除壞死部分和纖維組織置于無(wú)菌器皿中。將瘤組織剪成碎片，于組織研磨器中加入4 ml生理鹽水輕輕研磨成組織勻漿液，200目細(xì)胞篩過(guò)濾，制成單細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色，光鏡下計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，用生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度約為1×107/ml。用1 ml的注射器取上述懸液0.2 ml，于空白組外每只小鼠右前肢腋內(nèi)皮下接種。造模后按體質(zhì)量隨機(jī)分成空白組、模型組、化療組、辰時(shí)中藥+化療組(簡(jiǎn)稱辰時(shí)組)、午時(shí)中藥+化療組(簡(jiǎn)稱午時(shí)組)、亥時(shí)中藥+化療組(簡(jiǎn)稱亥時(shí)組)6組，每組10只。

1.4 給藥時(shí)間及給藥方法

于腋下造模第5天確認(rèn)造模成功后開(kāi)始給藥。空白組不做任何處理，各時(shí)辰組灌胃扶正祛邪抗癌方每天1次并腹腔注射順鉑化療隔天1次，化療組腹腔每天上午9∶00注射順鉑化療隔天1次并每天灌胃等量生理鹽水，對(duì)照組采取等量生理鹽水灌胃以及腹腔注射持續(xù)2周。中藥擇時(shí)灌胃取時(shí)為常人早、中、晚(睡前)服藥時(shí)間，分別對(duì)應(yīng)十二時(shí)辰中辰時(shí)(胃經(jīng)旺時(shí)：7∶00-9∶00)、午時(shí)(心經(jīng)旺時(shí)：11∶00-13∶00)、亥時(shí)(三焦經(jīng)旺時(shí)：21∶00-23∶00)。

1.5 標(biāo)本制備及指標(biāo)檢測(cè)

各組小鼠用藥結(jié)束后第2天開(kāi)始收集標(biāo)本，摘眼球取血收集血標(biāo)本，分別裝入加EDTA抗凝管中及2 mlEP管中。其中2 mlEP管中血液在冷藏15 min后給予離心機(jī)3000 r/min，離心15 min取上層血清，-20 ℃冰箱保存待測(cè)。而EDTA抗凝管中血液迅速用于紅細(xì)胞和白細(xì)胞計(jì)數(shù)。處死小鼠后進(jìn)行骨髓標(biāo)本制備，來(lái)源于小鼠完整左側(cè)股骨，制備的骨髓細(xì)胞液放入5 mlEP管中待測(cè)。小鼠血清粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)含量測(cè)定嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般狀況影響

本次實(shí)驗(yàn)小鼠60只，死亡2只，為模型組、化療組各死亡1只。實(shí)驗(yàn)初，各組小鼠進(jìn)食、飲水、活動(dòng)等一般狀況差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。造模后第5天，除空白組外各組小鼠腋下均可及直徑約2～5 mm硬結(jié)，成瘤率100%。隨著用藥時(shí)間的推移和腫瘤的增長(zhǎng)，模型組、化療組、各時(shí)辰用藥組小鼠進(jìn)食、進(jìn)水、清理皮毛等活動(dòng)均有減少，小鼠精神萎靡，被毛無(wú)光，喜歡群聚。而空白組小鼠進(jìn)食、飲水等一般狀況無(wú)明顯改變。

2.2 小鼠外周血白細(xì)胞和紅細(xì)胞比較

表1顯示，與模型組比較，化療組及辰時(shí)組、午時(shí)組的白細(xì)胞和紅細(xì)胞明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與化療組比較，各時(shí)辰用藥組的白細(xì)胞計(jì)數(shù)有所回升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與午時(shí)組比較，亥時(shí)組的白細(xì)胞計(jì)數(shù)回升較明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而紅細(xì)胞計(jì)數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各實(shí)驗(yàn)組小鼠外周血白細(xì)胞和紅細(xì)胞計(jì)數(shù)比較

注：與模型組比較：★P<0.05；與化療組比較：△P<0.05，與午時(shí)組比較：○P<0.05

2.3 小鼠骨髓有核細(xì)胞比較

表2顯示，與模型組比較，化療組及辰時(shí)組、午時(shí)組、亥時(shí)組的骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?；熃M骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)下降均最為明顯，與化療組比較，各時(shí)辰組均有不同回升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與辰時(shí)組及午時(shí)組比較，亥時(shí)組骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)回升較明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各實(shí)驗(yàn)組小鼠骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)比較

注：與模型組比較：★P<0.05；與化療組比較：△P<0.05，與午時(shí)組比較：○P<0.05

2.4 小鼠血清EPO、G-CSF含量比較

表3顯示，各實(shí)驗(yàn)組小鼠血清EPO、G-CSF含量均出現(xiàn)不同程度下降，與模型組比較，化療組血清EPO、G-CSF含量下降最為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與化療組比較，亥時(shí)組血清EPO、G-CSF含量明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而各時(shí)辰用藥組血清EPO、G-CSF含量均出現(xiàn)不同程度回升，與辰時(shí)組比較，亥時(shí)組血清G-CSF含量回升較明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而亥時(shí)組血清EPO含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 各實(shí)驗(yàn)組小鼠血清G-CSF、EPO含量比較

注：與模型組比較：P<0.05；與化療組比較：△P<0.05，與辰時(shí)組比較：○P<0.05

3 討論

中醫(yī)治療惡性腫瘤的主要法則是“扶正祛邪化毒”，而肺癌患者本身機(jī)體?？沙霈F(xiàn)免疫抑制狀態(tài)，故在治療中應(yīng)增強(qiáng)患者免疫力，提高機(jī)體抗腫瘤能力[3，4]。扶正祛邪抗癌方由當(dāng)歸、黃芪、黨參、白花蛇舌草、石見(jiàn)穿5味藥物組成。方中重用黃芪為君，意在補(bǔ)氣生血、實(shí)衛(wèi)固表；用當(dāng)歸、黨參為臣，當(dāng)歸補(bǔ)血和營(yíng)，黨參補(bǔ)脾肺氣兼而補(bǔ)血，兩者配合黃芪氣血雙補(bǔ)，使補(bǔ)氣扶正，氣旺血生，陽(yáng)有所附；白花蛇舌草、石見(jiàn)穿為佐，兩藥清熱解毒、消腫散結(jié)，用以消散癌腫，使邪去正安。全方配合使用，適用于治療晚期肺癌尤其是肺癌化療后所致虛實(shí)夾雜之證。

中醫(yī)時(shí)間醫(yī)學(xué)是國(guó)醫(yī)大師李濟(jì)仁及其弟子胡建北在國(guó)內(nèi)較早開(kāi)展的研究項(xiàng)目，并取得了較好的成果。“強(qiáng)調(diào)服藥時(shí)間，注重動(dòng)靜宜忌”；“推崇數(shù)方并用，主張定時(shí)分服”是其主要學(xué)術(shù)思想之一。本研究中扶正祛邪抗癌方可減輕化療所引起的骨髓抑制，表現(xiàn)在各時(shí)辰用藥組外周血白細(xì)胞、紅細(xì)胞以及骨髓有核細(xì)胞數(shù)目均出現(xiàn)不同程度回升，表明扶正抗癌祛邪方可以減輕化療藥物所引起的骨髓抑制，對(duì)骨髓造血功能具有保護(hù)作用。其中亥時(shí)用藥組中亥時(shí)組外周血白細(xì)胞、紅細(xì)胞以及骨髓有核細(xì)胞數(shù)目回升最為明顯，與其他時(shí)辰用藥組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明不同時(shí)段服用扶正抗癌祛邪方對(duì)小鼠外周血及骨髓造血功能具有不同影響。而針對(duì)白細(xì)胞、紅細(xì)胞以及骨髓有核細(xì)胞數(shù)目回升的不同，考慮與各系細(xì)胞增殖周期相關(guān)。

血細(xì)胞的產(chǎn)生源于骨髓造血干細(xì)胞，而一些作用于造血前體細(xì)胞的造血生長(zhǎng)因子可以促進(jìn)骨髓造血細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)各系幼稚細(xì)胞成熟，如EPO和G-CSF、GM-CSF、IL-3等。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，一些中草藥可以提高人體血清中造血生長(zhǎng)因子如EPO、G-CSF等的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)骨髓造血。臨床常用于骨髓抑制后造血功能修復(fù)的中藥有黃芪、當(dāng)歸、黨參等。黃芪的主要有效成分為黃芪多糖，研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖可提升腫瘤患者免疫功能[5]，并能提高患者生活質(zhì)量，延長(zhǎng)生存時(shí)間[6]。另有研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖對(duì)注射環(huán)磷酰胺引起的小鼠骨髓抑制模型的造血功能具有修復(fù)作用，黃芪多糖可明顯增加實(shí)驗(yàn)小鼠骨髓細(xì)胞及外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)，且存在一定的量效關(guān)系[7]。當(dāng)歸多糖對(duì)造血功能的亦有不錯(cuò)保護(hù)效果[8]。有研究指出，經(jīng)當(dāng)歸多糖誘導(dǎo)的骨髓巨噬細(xì)胞培養(yǎng)后上清液可以提升髓系造血祖細(xì)胞集落產(chǎn)生率，其表達(dá)的EPO、GM-CSF、IL-3、IL-6蛋白水平均出現(xiàn)不同程度的提高，而EPO mRNA以及GM-CSF mRNA的表達(dá)水平明顯提高，證明當(dāng)歸多糖可以直接或間接刺激造血，誘導(dǎo)微環(huán)境中的骨髓巨噬細(xì)胞從基因和蛋白水平上促進(jìn)造血因子的合成與分泌[9]。有學(xué)者認(rèn)為，當(dāng)歸多糖對(duì)造血?jiǎng)訂T的調(diào)控可能與降低造血細(xì)胞表面某些黏附分子表達(dá)相關(guān)[10]。本研究化療組EPO、G-CSF含量下降，提示化療可引起造血生長(zhǎng)因子EPO、G-CSF表達(dá)的降低，而扶正祛邪抗癌方可以影響小鼠血清中EPO、G-CSF的表達(dá)，表現(xiàn)為各時(shí)辰用藥組EPO、G-CSF含量的回升。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，亥時(shí)用藥組小鼠G-CSF含量回升最明顯，表明不同時(shí)段用藥對(duì)機(jī)體造血功能產(chǎn)生不同影響，而時(shí)間醫(yī)學(xué)在腫瘤治療中應(yīng)用的目的就在于使化療中選擇藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷最強(qiáng)而對(duì)正常組織損傷最小的時(shí)間治療，以及選擇促進(jìn)化療后組織恢復(fù)的最佳時(shí)間進(jìn)行治療。我們認(rèn)為其可能與擇時(shí)用藥促進(jìn)造血因子的釋放，不同時(shí)段骨髓造血前體細(xì)胞對(duì)造血因子的敏感不同相關(guān)，其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

[1] 李瑞娜. 肺癌流行病學(xué)和病因?qū)W研究[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2009,25(11): 1904-1905.

[2] 陳仁杰,張金良,闞海東.中國(guó)大氣污染與肺癌關(guān)系的流行病學(xué)研究回顧[J].衛(wèi)生研究,2011,40(2):243-245.

[3] 李艷.扶正祛邪化毒法在腫瘤治療中的應(yīng)用[J].中醫(yī)藥臨床雜志,2009,21(6): 487-489.

[4] 單保恩.IL-12家族細(xì)胞因子:腫瘤免疫治療研究的熱點(diǎn)分子[J]. 中國(guó)腫瘤生物治療雜志,2011,18(3):239-244.

[5] 邢秀玲,田菲,賈文娟. 注射用黃芪多糖對(duì)晚期肺癌患者生活質(zhì)量的影響[J].河南中醫(yī),2009,29(3):262-263.

[6] 金璋,沈潔.注射用黃芪多糖對(duì)II-III期非小細(xì)胞肺癌放療患者免疫功能的影響[J].中草藥,2009,40(4):611-612.

[7] 徐尚福,楊天華,吳芹,等.黃芪多糖對(duì)環(huán)磷酰胺引起小鼠骨髓抑制后造血功能的修復(fù)作用[J]. 遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2011,34(5):473-476.

[8] 何曉莉,張雁,吳宏,等.當(dāng)歸多糖對(duì)輻射損傷小鼠造血系統(tǒng)保護(hù)作用的研究[J].重慶醫(yī)學(xué), 2012,41(35):3724-3736.

[9] 李靜,王亞平.當(dāng)歸多糖對(duì)骨髓巨噬細(xì)胞的影響及其與造血調(diào)控的關(guān)系[J]. 中草藥,2005,36(1):69-72.

[10] 杜小麗,王改琴,吳宏. 當(dāng)歸多糖對(duì)小鼠造血細(xì)胞表面黏附分子表達(dá)的影響[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2008,33(3):274-276.

[11] 胡劍北.中西醫(yī)結(jié)合時(shí)間治療學(xué)[M].合肥：安徽科技出版社，2008：5.