金玉蘭，邢 剛，阮系真

(浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州310058)

隨著人類基因組的繪制成功，標(biāo)志著后基因組時(shí)代的到來(lái)。由于基因的功能主要是通過(guò)其表達(dá)的蛋白質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)，要了解該基因的全部信息，必須對(duì)其編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行深入研究。蛋白質(zhì)組學(xué)分析為研究微生物的生命活動(dòng)和細(xì)胞功能提供了廣闊的視野。因此，蛋白質(zhì)組學(xué)在生命科學(xué)研究中具有十分重要的位置，隨著研究的不斷深入，蛋白質(zhì)組學(xué)必將對(duì)人類的生活和生產(chǎn)帶來(lái)十分重大的影響。本文主要就目前微生物蛋白質(zhì)組學(xué)的研究現(xiàn)狀進(jìn)行簡(jiǎn)要闡述。

蛋白質(zhì)組學(xué)是指研究一個(gè)細(xì)胞、一個(gè)組織或一種生物在給定的時(shí)期、特殊條件下表達(dá)的所有蛋白質(zhì)的總和。蛋白質(zhì)組學(xué)研究通過(guò)對(duì)生物體內(nèi)表達(dá)的各種蛋白質(zhì)進(jìn)行識(shí)別和定量分析，確定其在細(xì)胞內(nèi)外的定位、修飾、相互作用和功能，以期獲得對(duì)生命本質(zhì)和活動(dòng)規(guī)律的全景式認(rèn)識(shí)。相對(duì)于其他生物，微生物結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易于培養(yǎng)和處理。同時(shí)，許多動(dòng)物在代謝過(guò)程中所需基因在微生物體系中也是保守的，所以微生物是研究蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)體系的理想模式生物。為此，微生物蛋白質(zhì)組學(xué)已被用于解決某些復(fù)雜的生物學(xué)問(wèn)題，有眾多的微生物蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果發(fā)表。本文中，我們選擇了目前微生物蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一些亮點(diǎn)進(jìn)行綜述，以期為同行研究提供參考。

1 基于質(zhì)譜鑒定技術(shù)改進(jìn)的基因組注釋

越來(lái)越多的微生物基因組被測(cè)序，且新一代的測(cè)序系統(tǒng)速度仍在加快，在對(duì)這些基因組序列進(jìn)行注釋的過(guò)程中遇到的最大挑戰(zhàn)就是準(zhǔn)確預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的編碼區(qū)。

為解決該問(wèn)題，Jaffe 等(2000)［1］建議使用蛋白質(zhì)組學(xué)信息對(duì)基因組注釋進(jìn)行系統(tǒng)的驗(yàn)證和改進(jìn)。該實(shí)驗(yàn)小組通過(guò)對(duì)肺炎支原體M129 株689 個(gè)預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)編碼區(qū)進(jìn)行驗(yàn)證，最后通過(guò)MS/MS 方法共驗(yàn)證了557 個(gè)蛋白質(zhì)編碼區(qū)。

另外，Jaffe 等(2000)［1］應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)鑒定了16 個(gè)新的蛋白質(zhì)編碼區(qū)，糾正了19 個(gè)ORFs的N 端翻譯起始點(diǎn)，修改了9 個(gè)不編碼蛋白的ORFs。這種方法其實(shí)也叫蛋白質(zhì)基因組學(xué)，并被廣泛用于改進(jìn)某些細(xì)菌的基因組注釋，例如異常球菌屬，若干分支桿菌，耶爾森菌屬KIM 及兩個(gè)細(xì)菌菌落基因組等［2－3］。

總的來(lái)說(shuō)，上述研究表明，通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)試驗(yàn)對(duì)基因組注釋進(jìn)行驗(yàn)證和校正是一種十分有用的方法。

2 定性和定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究

定性蛋白質(zhì)組學(xué)研究揭示了某些特殊原核生物，尚不為人知的驚奇生理活動(dòng)。

例如，有研究者鑒定了硫礦硫化葉鈞P2 株的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，過(guò)去人們普遍認(rèn)為這類古生菌沒有糖原異生過(guò)程［4］，還有研究者鑒定了厭氧粘細(xì)菌2CP 過(guò)去認(rèn)為不存在的發(fā)酵通路。有人對(duì)既定生長(zhǎng)條件下的表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行研究，鑒定了某些與特定生理過(guò)程相關(guān)的蛋白質(zhì)和通路。也有人利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)白喉棒狀桿菌和結(jié)核分支桿菌等致病菌的表面蛋白特點(diǎn)進(jìn)行分析，鑒定了新的參與宿主細(xì)胞粘附和侵襲的新蛋白［5－6］。

Ziebandt 等(2010)［7］采用同樣方法分析了25株臨床金黃色葡萄球菌菌株的分泌蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)只有一個(gè)確定蛋白之間的有限重疊，表達(dá)蛋白質(zhì)之間的高度異質(zhì)性可能會(huì)阻礙疫苗的開發(fā)。Otto 等(2010)［8］對(duì)枯草芽胞桿菌在葡萄糖饑餓條件下的蛋白質(zhì)組學(xué)變化進(jìn)行了檢測(cè)。作者利用N 同位素標(biāo)記監(jiān)測(cè)了枯草芽胞桿菌在對(duì)數(shù)期過(guò)渡到穩(wěn)定期5個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的蛋白質(zhì)組學(xué)變化。證實(shí)許多代謝途徑，如糖降解和氨基酸合成被關(guān)閉，生長(zhǎng)停滯，而糖異生和三羧酸循環(huán)被誘導(dǎo)。

目前，半定量方法已被成功應(yīng)用于改善生物技術(shù)。例如，對(duì)乳酸乳球菌的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，已被用于確定人類纖維化跨膜電導(dǎo)調(diào)節(jié)器CFTR 異源表達(dá)潛在的瓶頸。應(yīng)用差別標(biāo)記和LC-MALDI-TOF MS/MS 對(duì)野生型和表達(dá)CFTR 的L.lactis 細(xì)胞進(jìn)行總蛋白表達(dá)模式分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在表達(dá)CFTR 的乳酸乳球菌中，有一些與蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊相關(guān)的蛋白質(zhì)被誘導(dǎo)。因此，作者就CFTR 的表達(dá)量整體降低提出了兩個(gè)假說(shuō)。一是CFTR 的正確折疊被細(xì)胞認(rèn)為是錯(cuò)誤折疊，從而引發(fā)應(yīng)激。二是該蛋白要正確折疊則需其它伴侶分子的協(xié)助。在另一項(xiàng)研究中，蛋白組學(xué)信息被用來(lái)改善大腸桿菌中異質(zhì)N-糖基化的活性。試驗(yàn)結(jié)果表明，提高乙醛酸循環(huán)的活性可以增加Arc A 糖蛋白的糖基化率，該推測(cè)已被其它試驗(yàn)所證實(shí)［9］。

除了研究細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)組成，蛋白質(zhì)組學(xué)方法也被用來(lái)分析蛋白質(zhì)的翻譯后修飾。磷酸化在真核細(xì)胞的調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，但對(duì)于其在細(xì)菌內(nèi)的分布范圍及作用目前卻知之甚少。有幾種方法可以檢測(cè)蛋白質(zhì)的磷酸化?；谀z的試驗(yàn)中，可以通過(guò)特殊染色或放射性標(biāo)記，如33P 檢測(cè)磷酸化蛋白。在無(wú)凝膠分離試驗(yàn)中，通過(guò)親和純化富集試驗(yàn)樣品后，利用串聯(lián)質(zhì)譜可以檢測(cè)到某些磷酸鹽殘基。這兩種方法都可以確定細(xì)菌內(nèi)的磷酸化蛋白及磷酸化位點(diǎn)，如枯草芽胞桿菌，大腸桿菌、谷氨酸棒狀桿菌和肺炎支原體。每個(gè)研究均發(fā)現(xiàn)有63～79 個(gè)磷酸化的蛋白質(zhì)，這表明磷酸化在細(xì)菌調(diào)控和動(dòng)態(tài)變化過(guò)程中可能發(fā)揮著十分重要的作用。

糖基化是另一種翻譯后修飾，也是原核生物研究中的一個(gè)熱點(diǎn)課題。糖鏈的精確結(jié)構(gòu)特征是目前研究中的一個(gè)巨大挑戰(zhàn)，目前很多研究還局限于糖蛋白的檢測(cè)。精確的糖蛋白結(jié)構(gòu)鑒定仍然需要一些專業(yè)的技術(shù)，如核磁共振技術(shù)，基于質(zhì)譜鑒定分析技術(shù)的發(fā)展，這些先進(jìn)技術(shù)的發(fā)展才能為研究原核生物內(nèi)糖基化多樣性及糖基化程度提供某些線索［10］。

3 宏蛋白質(zhì)組學(xué)

大多數(shù)細(xì)菌蛋白質(zhì)組學(xué)是對(duì)純培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行研究。但是，自然界的細(xì)菌多生長(zhǎng)在一個(gè)相互聯(lián)系的群落中，人們期待對(duì)這些細(xì)菌菌落間的相互作用及代謝交換作更深入的了解。作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)組學(xué)的一個(gè)自然延伸，宏蛋白質(zhì)組學(xué)，也就是對(duì)細(xì)菌菌落進(jìn)行全面整體蛋白質(zhì)分析的一種研究方法。

長(zhǎng)期來(lái)，基因組序列的限制和較低的蛋白質(zhì)鑒定率阻礙了細(xì)菌群落的研究。全球第一個(gè)應(yīng)用宏蛋白質(zhì)組學(xué)研究的是對(duì)生長(zhǎng)在加利福尼亞鐵山附近酸性礦山下水道中的自然生物膜菌群落的蛋白質(zhì)組學(xué)研究［11］。通過(guò)鳥槍蛋白質(zhì)組學(xué)方法從含量最多的前5 個(gè)物種中共鑒定了至少2000 種蛋白質(zhì)。其中約48%的蛋白質(zhì)來(lái)自于含量最高的有機(jī)體生物膜，即鉤端螺旋菌Ⅱ。該研究揭示了大量與氧化脅迫有關(guān)的蛋白質(zhì)，表明氧化損傷是在富含金屬的酸性環(huán)境中生存的一個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn)因素。對(duì)這個(gè)群落的后續(xù)研究表明:這些保護(hù)性蛋白是胞外多糖基質(zhì)細(xì)胞的一部分，另外這些蛋白的濃度可能與生物膜的發(fā)育狀態(tài)有關(guān)。

Pan 等(2011)［12］用15N 標(biāo)記方法研究了生物膜群落的蛋白質(zhì)組學(xué)變化。因此，同位素標(biāo)記技術(shù)可能是一項(xiàng)被用于跟蹤細(xì)菌群落中蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)和表達(dá)的新技術(shù)。

目前，宏蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)上的限制仍然是缺乏復(fù)雜群落的基因組信息。但由于測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，這種情況可能不會(huì)持續(xù)很久。宏蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的另一個(gè)挑戰(zhàn)是群落的高度復(fù)雜性及某些群落物種信息的匱乏。

盡管如此，目前宏蛋白質(zhì)組學(xué)研究所取得的成績(jī)還是令人鼓舞的，隨著技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，復(fù)雜群落的完整蛋白質(zhì)組學(xué)分析乃觸手可及。

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