鄭明英，蔡友華，陸最青，嚴(yán)杰能，張雪，張翀，李和平，邢新會(huì)

1(廣東肇慶星湖生物科技股份有限公司，廣東肇慶，526060)

2(清華大學(xué)化工系，北京，100084)3(清華大學(xué)工程物理系，北京，100084)

L-脯氨酸又稱(chēng)L-吡咯烷-2-羧酸，是氨基酸發(fā)酵工業(yè)中的重要產(chǎn)品之一。它廣泛應(yīng)用于合成治療高血壓和心肌衰竭的新藥，如巰甲丙脯酸、苯丁酯丙脯酸。作為復(fù)方氨酸輸液原料之一，L-脯氨酸在營(yíng)養(yǎng)不良、蛋白質(zhì)缺乏癥、嚴(yán)重腸胃道疾患、燙傷及外科手術(shù)后的蛋白質(zhì)補(bǔ)充等方面具有廣泛應(yīng)用［1-3］。由于L-脯氨酸具有一定的甜度，食品工業(yè)上亦可作為食品添加劑使用。

由清華大學(xué)自主研發(fā)的新型常壓室溫等離子體(ARTP)微生物基因組快速突變技術(shù)具有射流溫度低(室溫范圍)，產(chǎn)生的等離子體均勻，無(wú)需真空裝置，操作簡(jiǎn)易，成本低等優(yōu)點(diǎn)，ARTP的主要成分是活性離子，其與生物大分子和細(xì)胞作用效果明顯，產(chǎn)生突變的多樣性大［4-7］。一系列研究表明，ARTP技術(shù)可以快速有效地突變細(xì)菌、微藻、真菌、酵母等微生物［8-10］，已成為獲得高得率菌株的有效方法。本文以L-脯氨酸生產(chǎn)菌株(嗜醋酸棒桿菌)為出發(fā)菌株，建立了ARTP育種新技術(shù)快速突變和高通量篩選脯氨酸高產(chǎn)菌株的方法，篩選到16株與野生菌在生長(zhǎng)特性和脯氨酸產(chǎn)率有區(qū)別的菌株，并對(duì)其中1株高產(chǎn)菌株D3進(jìn)行了發(fā)酵性能的研究，為進(jìn)一步提高L-脯氨酸產(chǎn)業(yè)化水平提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與儀器

脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，星湖生物科技股份有限公司提供。葡萄糖、酵母抽提物，OXOID，England;CaCo3，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

搖床(SKY-2102)，超凈臺(tái)(HDL哈東聯(lián))，離心機(jī)(KUBOTA5922，日本制造)，金屬浴(HB-100)，酶標(biāo)儀(TECAN infinite M200 PRO)，ARTP育種機(jī)(北京思清源生物科技有限公司，北京)。

1.2 菌種和培養(yǎng)基

菌種:谷氨酸生產(chǎn)菌嗜醋酸棒桿菌拉丁名ATCC13870，由廣東肇慶星湖生物科技股份有限公司提供。

種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，酵母膏3，尿素2，玉米漿粉10，NaCl 3，用NaOH調(diào) pH 至8.0，121℃滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖70，玉米漿15，味精50，(NH4)2SO455，KH2PO41，MgSO40.5，硫胺素 100 μg/L，CaCO330，用NaOH調(diào)pH至7.2。葡萄糖分消118℃滅菌15 min。其余成分于121℃滅菌15 min。

1.3 ARTP誘變方法

電源功率為115 W，工作氣流量為10 L/min，等離子體發(fā)射源與樣品之間距離為2 mm，樣品量為10 μL(培養(yǎng)6 h的菌液)，此條件下誘變的突變效率最高［10］。氦氣作為工作氣體，分別考察照射時(shí)間為1、2、3、4、5、6、7、8 和9 min 時(shí)的細(xì)菌致死率。對(duì)處理過(guò)的樣品在適當(dāng)?shù)南♂尪认峦堪?，通過(guò)菌落數(shù)來(lái)計(jì)算致死率，并獲得致死曲線:

其中，U為不經(jīng)過(guò)誘變處理對(duì)照菌的總菌落數(shù);T為經(jīng)誘變處理后對(duì)應(yīng)的總菌落數(shù)。

1.4 高通量篩選模型建立

為了快速篩選到高脯氨酸產(chǎn)率的菌株，本實(shí)驗(yàn)室置備了智能的移液工作站以及標(biāo)準(zhǔn)化的孔板離心機(jī)，結(jié)合深孔的48孔板，建立了高通量篩選模型，其工作 流程如圖1所示。

圖1 ARTP誘變及其高通量篩選流程圖Fig.1 Schematic diagram of the ARTP mutation and high throughput screening

1.5 分析方法

1.5.1 細(xì)胞生物量測(cè)定

吸取0.1 mL發(fā)酵液，用0.1 mol/L HCl稀釋100倍，在650 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度。

1.5.2 脯氨酸含量的測(cè)定

采用茚三酮顯色法測(cè)定脯氨酸含量［11］。吸取發(fā)酵液，適當(dāng)稀釋?zhuān)♂屢簼舛瓤刂圃?.005～0.050 mg/mL。取稀釋液40 μL于EP管中，然后分別加入40 μL茚三酮溶液和40 μL冰醋酸，在金屬浴中100℃顯色1 h，冷卻至室溫后加入80 μL冰醋酸，使體積為200 μL，用酶標(biāo)儀于515 nm波長(zhǎng)處測(cè)定A515nm值。制作茚三酮標(biāo)準(zhǔn)曲線求得公式，通過(guò)公式計(jì)算出含量后，再乘以稀釋倍數(shù)×1/10即得發(fā)酵液的脯氨酸濃度。

1.5.3 突變株遺傳穩(wěn)定性分析

為了分析突變菌的遺傳穩(wěn)定性，在固體板上活化菌，轉(zhuǎn)移到液體進(jìn)行一級(jí)培養(yǎng)，連續(xù)轉(zhuǎn)移10次，然后分析比較突變株產(chǎn)脯氨酸能力的遺傳穩(wěn)定性。

2 分析與結(jié)果

2.1 ARTP致死率曲線的測(cè)定

按照方法1.3對(duì)脯氨酸生產(chǎn)菌的ARTP致死率曲線進(jìn)行了測(cè)定，如圖2所示。

由圖2可知，ARTP對(duì)脯氨酸生產(chǎn)菌具有較強(qiáng)的致死能力，按方法1.5.3對(duì)菌體的致死率進(jìn)行了計(jì)算，照射2 min后其致死率達(dá)到了98.7%，為提高獲得高脯氨酸生產(chǎn)能力和生存能力較強(qiáng)菌株的幾率，本研究把致死率控制在99%以上，在后續(xù)的研究中誘變時(shí)間定為4 min。

2.2 突變菌株的篩選

取10 μL生長(zhǎng)6 h(OD值為1.2～1.8)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的種子液，點(diǎn)滴在誘變載片進(jìn)行ARTP誘變4 min后，載片放入已裝500 μL種子培養(yǎng)基的離心管，搖勻，分別稀釋10-2和10-3，取100 μL稀釋液涂板，30oC培養(yǎng)36～48 h后，對(duì)應(yīng)10-2和10-3的平板分別平均長(zhǎng)出22～28個(gè)和12～18個(gè)單菌落，按上述步驟平行共做了10塊載片，根據(jù)生長(zhǎng)菌落的圓整和豐滿(mǎn)度，隨機(jī)挑取144個(gè)單菌落到48孔板進(jìn)行高脯氨酸產(chǎn)率菌株的初篩，結(jié)果表明，144個(gè)菌株較野生菌都有不同程度的提高，其中16個(gè)菌株產(chǎn)酸能力與野生菌的比較如圖3所示。

圖3 野生菌和16個(gè)突變株培養(yǎng)48 h的脯氨酸產(chǎn)量Fig.3 The proline production of 16 mutants andwild type after 48h fermentation

由圖3可知，其中W0為野生菌，在16個(gè)突變株中，C2，D2和D3的脯氨酸生產(chǎn)能力，相比較與野生菌，脯氨酸產(chǎn)量分別提高了 15.74%、15.46%和16.57%。而其它突變株則只略有提高，由此在后續(xù)的復(fù)篩實(shí)驗(yàn)中，繼續(xù)考察C2，D2和D3與野生菌產(chǎn)脯氨酸的情況。

2.3 突變株發(fā)酵特性的研究

初篩結(jié)果與野生菌相比較，在孔板中的產(chǎn)酸情況，C2、D2和D3表現(xiàn)出較好的性能，通過(guò)搖瓶實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行復(fù)篩，進(jìn)一步考察其脯氨酸生產(chǎn)性能，結(jié)果如表1所示。

表1 3個(gè)突變株搖瓶發(fā)酵復(fù)篩結(jié)果Table 1 Proline production and cell growth of three mutants in the second screening step using flask culture

由表1可知，相比較與野生菌，在搖瓶發(fā)酵結(jié)果中，突變株C2，D2和D3同樣表現(xiàn)出較好的脯氨酸生產(chǎn)性能，并且其生長(zhǎng)趨勢(shì)、產(chǎn)酸趨勢(shì)與深孔板表現(xiàn)完全一致。由此，在后續(xù)的篩選實(shí)驗(yàn)中，可以根據(jù)初篩結(jié)果，初步確定哪一株菌株的發(fā)酵性能情況，以備后續(xù)的小試和中試驗(yàn)證。在3株突變株中，48 h內(nèi)的發(fā)酵情況D3表現(xiàn)出更快的生長(zhǎng)速度和更高的產(chǎn)酸性能。與野生菌W0相比，突變株D3在發(fā)酵48 h的脯氨酸濃度提高了20.29%，在5%水平上具有顯著性差別。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇D3繼續(xù)開(kāi)展其生長(zhǎng)特性與遺傳穩(wěn)定性研究。

2.4 突變株D3生長(zhǎng)特性的研究

為更好掌握突變株D3的脯氨酸發(fā)酵特性，本節(jié)實(shí)驗(yàn)以種子培養(yǎng)基為培養(yǎng)基，對(duì)其生長(zhǎng)曲線、pH和溫度范圍與野生菌進(jìn)行比較，結(jié)果如圖4、圖5和圖6所示。

由圖4可知，野生菌與D3突變株的生長(zhǎng)趨勢(shì)基本一致，都表現(xiàn)出延滯期較短，能迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，D3突變株的生長(zhǎng)速率則略快于野生菌。對(duì)其pH范圍研究表明，如圖5所示野生菌和D3突變株在pH范圍為5～11時(shí)均能生長(zhǎng)。由圖6可知，野生菌與D3對(duì)溫度都非常敏感，其最適的溫度為30.5℃。

2.5 突變株D3遺傳穩(wěn)定性考察

按照方法1.5.4，對(duì)D3突變株的生長(zhǎng)及脯氨酸生產(chǎn)的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行了考察，如圖7所示。

圖4 野生菌與D3突變株生長(zhǎng)曲線的比較Fig.4 The typical growth curves of wild strain and mutant D3

圖5 野生菌與D3突變株在不同pH條件下的的生長(zhǎng)情況Fig.5 The growth performance of wild strain and mutant D3 at different pH

圖6 野生菌與D3突變株生長(zhǎng)溫度范圍的比較Fig.6 The growth performance of wild strain and mutant D3 at different temperatures

圖7 突變株D3的遺傳穩(wěn)定性分析Fig.7 The analysis of genetic stability for mutant D3

由圖7可知，D3連續(xù)傳代10次，分別發(fā)酵培養(yǎng)48 h，其OD值都在38.12左右，而脯氨酸濃度則都在6.41～6.69。以上結(jié)果表明，D3突變株具有較好的遺傳穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

本文構(gòu)建了ARTP快速誘變和高通量篩選獲得脯氨酸生產(chǎn)菌突變株的方法，得到以下結(jié)論:

(1)按方法1.3，經(jīng)ARTP誘變，照射4 min菌株致死率達(dá)到99%以上，表明ARTP對(duì)脯氨酸生產(chǎn)菌具有較高的致死效應(yīng)。在該誘變條件下，按方法1.4 ARTP誘變后的高通量篩選方法，篩選獲得16株脯氨酸生產(chǎn)能力比原始菌有不同程度提高的突變株。其中，3株突變菌株的脯氨酸生產(chǎn)能力提升最為明顯，進(jìn)一步經(jīng)搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，培養(yǎng)48 h后，D3表現(xiàn)出較好的生長(zhǎng)速率和更高的脯氨酸濃度，其OD650值和脯氨酸濃度分別為38.04和6.58(g/100 mL)，與野生菌相比較，分別提高了9.84%和20.29%。

(2)對(duì)D3的生長(zhǎng)曲線、pH和溫度范圍與野生菌進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，野生菌和D3具有類(lèi)似的生長(zhǎng)趨勢(shì)、最適的pH和溫度范圍，但是D3表現(xiàn)出更快的生長(zhǎng)速度，低pH下的耐受性較好。

(3)按方法1.6對(duì)D3連續(xù)傳代10次，每一代培養(yǎng)48h時(shí)的OD650值與脯氨酸產(chǎn)量基本沒(méi)有變化，表明經(jīng)ARTP誘變后突變株遺傳穩(wěn)定性高。

48深孔板和搖床的初步培養(yǎng)結(jié)果表明，經(jīng)ARTP誘變后的菌種無(wú)論在生長(zhǎng)速率還是脯氨酸濃度，都是有變化的，今后需要進(jìn)一步開(kāi)展以下兩方面的工作:對(duì)D3菌進(jìn)行基因組測(cè)序，并與野生菌基因組序列進(jìn)行比較分析，研究突變株的突變機(jī)理;在50～100 L發(fā)酵罐上進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證D3突變株的脯氨酸生產(chǎn)水平，并對(duì)其脯氨酸得率和發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行分析，為中試和生產(chǎn)提供工程數(shù)據(jù)。

［1］ 鄭素慧，李文軍，婁愷.L-脯氨酸發(fā)酵生產(chǎn)的研究進(jìn)展［J］.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，44(S2):6-10.

［2］ 繆正興，張仲明，李寶忠，等.L-脯氨酸的生產(chǎn)及其應(yīng)用［J］.上海醫(yī)藥情報(bào)研究，2004，2(73):1-3.

［3］ 張偉國(guó)，顧正華，康鴻.L-脯氨酸發(fā)酵條件的研究［J］.江蘇食品與發(fā)酵，2000(4):1-4.

［4］ Li HP，Li G，Sun WT，et al.Radio-frequency，atmospheric-pressure glow discharges:producing methods，characteristics and applications in bio-medical fields［J］.Complex Systems，2008，982:584-591.

［5］ Li G，Li HP，Wang LY，et al.Genetic effects of radio-frequency，atmospheric-pressure glow discharges with helium［J］.Appl Physics Lett，2008，92(22):221504.

［6］ Wang LY，Huang ZL，Li G，et al.Novel mutation breeding method forStreptomyces avermitilis using an atmospheric pressure glow discharge plasma［J］.J Appl Microbiol，2010，108(3):851-858.

［7］ Shi JJ，Kong MG.Expansion of the plasma stability range in radio-frequency atmospheric-pressure glow discharges［J］.Appl Phys Lett，2005，87(20):201 501.

［8］ 王立言.常壓室溫等離子體對(duì)微生物的作用機(jī)理及其應(yīng)用基礎(chǔ)研究［D］.北京:清華大學(xué)，2010.

［9］ Lu Yuan，Wang Liyan，Ma Kun，et al.Characteristics of hydrogen production of an Enterobacter aerogenes mutant generated by a new atmospheric and room temperature plas-ma(ARTP)［J］.Biochemical Engineering Journal，2011，55(1):17-22.

［10］ 金麗華，方明月，張翀，等.常壓等離子體快速誘變產(chǎn)油酵母的條件及其突變株的特性［J］.生物工程學(xué)報(bào)，2011，27(3):461-467.

［11］ 謝暢豐，陳超菊，林遠(yuǎn)聲.發(fā)酵后處理方法研究(XI)-L-脯氨酸高產(chǎn)酸研究［J］.中山大學(xué)學(xué)報(bào)論叢，1998(4):22-25.