谷化平 黃 勇 尚培中

我們采用免疫組化方法檢測(cè)膽管癌(CHC)、癌旁膽管組織 (TAC)和正常膽管組織(NBDT)中環(huán)氧化酶-2(cyclooxy-genase-2,COX-2)和細(xì)胞周期素D1(Cyclin D1)蛋白表達(dá)狀況，旨在探討其表達(dá)水平與CHC發(fā)生發(fā)展和臨床病理特征的關(guān)系，為判斷CHC患者的預(yù)后提供生物學(xué)參考指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源 選取我院2003年01月～2012年09月手術(shù)切除并經(jīng)病理檢查證實(shí)的膽管腺癌標(biāo)本50例。其中男性33例，女性17例，平均年齡(51.8±13.5)歲，年齡23～77歲；高、中分化癌35例、低分化癌15例；有轉(zhuǎn)移者31例(包括淋巴結(jié)、肝、膽囊、腸系膜和胰腺等),無轉(zhuǎn)移者19例。TNM分期: Ⅰ期10例,Ⅱ期18例，Ⅲ期14例，Ⅳ期8例。以與CHC同期的20例TAC(距瘤緣0.5 cm)和20例NBDT作為對(duì)照。標(biāo)本均經(jīng)40 g/L中性福爾馬林液固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。

1.1.2 試劑 鼠抗人COX-2和Cyclin D1單克隆抗體和LSAB試劑盒購自邁新生物技術(shù)公司(均為即用型)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色 免疫組織化學(xué)染色采用微波-EliVisionTM(MW- EliVisionTM)法，參照試劑盒說明書進(jìn)行操作。實(shí)驗(yàn)以已知COX-2和Cyclin D1陽性大腸癌組織作為陽性對(duì)照，以枸櫞酸緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。H2O2-DAB顯色。

1.2.2 結(jié)果判斷 COX-2陽性產(chǎn)物定位于細(xì)胞質(zhì)、Cyclin D1陽性產(chǎn)物定位于細(xì)胞核，呈棕黃色染色者為陽性。采用單盲法，每張切片在400倍顯微鏡下選定10個(gè)視野，計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)。陰性(-)：未見棕黃色顆粒；弱陽性(+)：陽性細(xì)胞數(shù)<25%；陽性(++)：陽性細(xì)胞數(shù)25%～75%；強(qiáng)陽性(+++)：陽性細(xì)胞數(shù)>75%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0 軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，免疫組化指標(biāo)間相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析，α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 COX-2和Cyclin D1在膽管良、惡性病變組織中的表達(dá)

CHC、TAC 和 NBDT中COX-2陽性表達(dá)率分別為78.0%(39/50)、43.3%(13/30)和0(0/20),差異有顯著性(χ2=9.90，χ2=43.03,P<0.05)，TAC 與 NBDT比較有顯著差異性(χ2=8.23，P<0.05)；CHC、TAC 和 NBDT中Cyclin D1陽性表達(dá)率分別為68.0%(36/50)、36.7%(11/30)和25.0%(5/20),差異有顯著性(χ2=9.66,χ2=13.01，P<0.05)，TAC 與 NBDT比較無顯著差異性(χ2=0.67，P>0.05)。

2.2 COX-2和Cyclin D1表達(dá)與CHC臨床病理參數(shù)的關(guān)系

COX-2表達(dá)與CHC患者性別、年齡和腫瘤分化程度無關(guān)(P>0.05),而與腫瘤TNM分期和轉(zhuǎn)移狀況相關(guān)(P<0.05)；Cyclin D1表達(dá)與CHC患者性別、年齡無關(guān)(P>0.05)，而與腫瘤分化程度、TNM分期和轉(zhuǎn)移狀況相關(guān)(P<0.05)，見表1。

表1 COX-2和Cyclin D1表達(dá)與CHC臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例，%)

2.3 膽管癌中COX-2與Cyclin D1表達(dá)間的相關(guān)性

39例COX-2表達(dá)陽性CHC中，Cyclin D1陽性表達(dá)有31例(79.5%)；11例COX-2陰性表達(dá)CHC中，Cyclin D1陽性表達(dá)有5例(45.5%)；CHC組織中COX-2表達(dá)與Cyclin D1表達(dá)呈顯著正相關(guān)(γ=0.32，P<0.05)。

3 討論

近年來腫瘤分子生物學(xué)研究表明，惡性腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移的發(fā)生是一個(gè)多基因、多因子各自發(fā)揮或相互協(xié)同作用的結(jié)果。因此，尋找、研究和揭示腫瘤的相關(guān)抗原或標(biāo)志物與腫瘤的關(guān)系，對(duì)腫瘤診斷、有效防治、預(yù)測(cè)預(yù)后及術(shù)后輔助治療提供依據(jù)具有十分重要意義。環(huán)氧合酶(cyclooxygenase,COX)又稱前列腺素內(nèi)過氧化物酶，是前列腺素合成過程中一個(gè)重要的限速酶，它可將花生四烯酸代謝成各種前列腺素產(chǎn)物，從而參與機(jī)體的多種病理生理過程，如炎癥、發(fā)熱及出凝血機(jī)制等。COX是膜結(jié)合蛋白，存在于核膜和微粒體膜[1]，它有2種同工酶，即結(jié)構(gòu)型COX-1和誘生型COX-2。COX-2是1種誘導(dǎo)性即刻反應(yīng)基因，在正常生理狀態(tài)下，絕大多數(shù)正常組織中檢測(cè)不到COX-2表達(dá)，只有當(dāng)細(xì)胞受到刺激才能迅速誘導(dǎo)表達(dá)COX-2。近年來研究表明，COX-2除在炎癥反應(yīng)中起重要作用外，尚與腫瘤密切相關(guān)，它可通過刺激腫瘤細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤血管形成、增強(qiáng)細(xì)胞侵襲力、抑制機(jī)體免疫功能、促進(jìn)癌前病變向腫瘤轉(zhuǎn)化等腫瘤的形成[2]。研究證實(shí)，包括大腸癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌和肺癌等腫瘤組織中COX-2表達(dá)均明顯增高，并與腫瘤的轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)[3～7]。本研究結(jié)果顯示，在NBDT→TAC→CHC中COX-2表達(dá)陽性率逐漸遞增(P<0.05)，并隨著CHC的TNM分期增高和器官轉(zhuǎn)移其表達(dá)陽性率亦隨之顯著增高(P<0.05)。有關(guān)COX-2表達(dá)與CHC分化程度的關(guān)系研究，目前存在不同結(jié)論。Kim等[5]研究結(jié)果，COX-2表達(dá)與CHC分化程度無關(guān)。Wu等[8]研究結(jié)果，COX-2表達(dá)與CHC分化程度有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，COX-2表達(dá)與CHC分化程度無關(guān)。提示，COX-2在膽管上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化、臨床進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過程中起著重要促進(jìn)作用，可能是CHC發(fā)生的早期事件，而對(duì)于判斷CHC的惡性程度方面意義不大。

Cyclin D1基因是1種原癌基因，定位于染色體11q13,為細(xì)胞周期的正性調(diào)控因子，與CDK4/CDK6結(jié)合并使之激活，活化的CDK4/CDK6使pRb在G1-S轉(zhuǎn)換期發(fā)生磷酸化，釋放出E2F，進(jìn)一步激活S期相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，推動(dòng)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，該基因編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)失控有可能引起細(xì)胞異常增殖而發(fā)生腫瘤。目前已發(fā)現(xiàn)Cyclin D1蛋白在人類許多惡性腫瘤如乳腺癌、食管癌、胃癌、膽囊癌、胰腺癌等組織中有過表達(dá)出現(xiàn)[9～11]。有關(guān)Cyclin D1基因在CHC中的研究文獻(xiàn)報(bào)道甚少，劉三光等[12]聯(lián)合應(yīng)用流式細(xì)胞分析術(shù)和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)，檢測(cè)了CHC、TAC 和 NBDT中的Cyclin D1蛋白和mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示在CHC、TAC 和 NBDT中，Cyclin D1蛋白和mRNA表達(dá)水平均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)(P<0.05)，認(rèn)為Cyclin D1基因轉(zhuǎn)錄和蛋白可能參與了CHC的發(fā)生發(fā)展過程。本研究結(jié)果表明Cyclin D1基因的改變?cè)贑HC發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，檢測(cè)Cyclin D1蛋白表達(dá)可作為判斷CHC惡性程度和生物學(xué)行為的參考指標(biāo)之一。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為腫瘤的發(fā)生是分子事件，是一個(gè)涉及多基因、多分子水平變化的多階段過程。本結(jié)果顯示，在CHC中COX-2和Cyclin D1表達(dá)呈正相關(guān)。提示在CHC的發(fā)生發(fā)展、臨床進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的病理過程中，COX-2和Cyclin D1可能發(fā)揮著協(xié)同作用，共同參與了CHC的演化過程。因此，在臨床病理活檢中檢測(cè)CHC中COX-2和Cyclin D1蛋白表達(dá)，從不同側(cè)面更有助于深入了解腫瘤的發(fā)生發(fā)展，并可為診斷、預(yù)后判斷和臨床基因治療提供重要依據(jù)。

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