梁俊平，李 健 ，李吉濤，劉萍，趙法箴，劉德月，戴芳鈺

(1.中國海洋大學，青島 266003;2.中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所，青島 266071)

脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)又名白蝦、小白蝦和迎春蝦等，隸屬節(jié)肢動物門(Arthropoda)、甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、長臂蝦科(Palaemonidae)、白蝦屬(Exopalaemon)，主要分布于我國整個大陸沿岸和朝鮮半島西岸的淺海低鹽水域，以渤海和黃海產(chǎn)量最高，是我國特有的3種經(jīng)濟蝦類之一，其產(chǎn)量僅次于中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis)和中國毛蝦(Acetes chinensis)［1-2］。由于其具有繁殖能力強、生長速度快、生長季節(jié)長和環(huán)境適應性廣等優(yōu)點，近年來，隨著沿海灘涂的開發(fā)，養(yǎng)殖面積也迅速擴大，據(jù)不完全統(tǒng)計，目前全國脊尾白蝦養(yǎng)殖面積達1萬余公頃，已成為池塘單養(yǎng)和其它種類混養(yǎng)的重要經(jīng)濟蝦類［3-6］，年平均效益可達1—2萬元/hm2［7-9］。脊尾白蝦具有良好的養(yǎng)殖前景，但目前的池塘養(yǎng)殖主要依靠捕撈海區(qū)天然蝦苗或投放抱卵親蝦自行繁殖苗種［8，10-11］，嚴重制約了規(guī)?；斯ゐB(yǎng)殖的發(fā)展。因此，在我國沿海地區(qū)進行規(guī)?；鷳B(tài)養(yǎng)殖脊尾白蝦，首先必須突破脊尾白蝦全人工苗種培育技術(shù)難關(guān)。

在蝦蟹類育苗中，溫度是關(guān)鍵因子之一，特別是對胚胎及幼體發(fā)育有重要的作用［12］。在羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)、凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)、中國對蝦(F.chinensis)、長毛對蝦(Fenneropenaeus Penicillatus)、紅螯光殼螯蝦(Cherax quadricarinatus)、克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)和鋸緣青蟹(Scylla serrata)［13-19］等多種養(yǎng)殖蝦蟹類中，均詳細研究了溫度對受精卵孵化及幼體變態(tài)發(fā)育的影響。而目前關(guān)于脊尾白蝦胚胎及幼體變態(tài)受溫度影響的研究較少，僅見20世紀80年代末王緒峨［20］對受精卵孵化做了初步的研究，為脊尾白蝦胚胎形態(tài)及早期發(fā)育奠定了一定的基礎(chǔ)。本文將探究脊尾白蝦胚胎發(fā)育生物學零度和有效積溫，以及幼體變態(tài)發(fā)育的最適溫度，以期豐富對脊尾白蝦早期個體發(fā)育的認識，為脊尾白蝦人工繁育技術(shù)的建立提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用脊尾白蝦捕自萊州灣，體長41.98—64.81 mm，體重 1.24—4.04 g，暫養(yǎng)于 200 L(80 cm×50 cm×50 cm)PVC水族箱內(nèi)，水溫(12.4±0.3)℃，充氣。投喂冷凍大鹵蟲，8:00和18:00各1次。每天定時吸污換水。

沙濾自然海水，鹽度31.2，pH 值8.2，NH3-Nm和 NO－2-N濃度分別低于0.05 mg/L和0.02 mg/L。

1.2 實驗方法

1.2.1 受精卵孵化溫度分組

挑選多對性成熟的雌、雄脊尾白蝦放入60 L(50 cm×40 cm×30 cm)PVC水族箱，每個水族箱內(nèi)各放1對，每天8:00和18:00各投餌1次，定時換同溫度海水1/5。準確記錄雌雄蝦交尾時間，交尾后將雄蝦移出，溫度設(shè)置及其變化范圍如表1所示，其中12℃組為自然水溫，其它溫度組采用加熱棒加溫，以0.5℃/h升溫，直至設(shè)置所需溫度。每天記錄各實驗組的溫度，直至Ⅰ期溞狀幼體(Z1)孵出。

表1 脊尾白蝦受精卵孵化溫度設(shè)置Table 1 The different water temperature levels of egg incubation of Exopalaemon carinicauda

1.2.2 幼體發(fā)育分組

設(shè)置18、20、22、24、26和28℃ 6個溫度梯度，每個溫度組設(shè)3個重復。將剛剛孵化出活力好的溞狀幼體隨機分布在1.5 L燒杯內(nèi)，水體為1 L，密度為20個/L，采用水浴加熱，以1℃/h升溫到設(shè)定溫度，微充氣。所有幼體均由同一親蝦所孵化。

溞狀幼體投喂鹵蟲無節(jié)幼體，每天3次，分別為9:00、14:00和19:00。每天上午投喂前換同溫度海水1/5，并記錄各發(fā)育階段的幼體數(shù)量。

1.2.3 幼體發(fā)育指數(shù)和存活率的計算

幼體發(fā)育指數(shù)(Larval stage index，LSI) 根據(jù)文獻［21］計算脊尾白蝦幼體發(fā)育指數(shù)，以表示幼體變態(tài)發(fā)育的快慢，幼體發(fā)育指數(shù)越大，則表示幼體變態(tài)越快。計算公式如下:

式中，Z1、Z2、…、Z6分別表示脊尾白蝦溞狀幼體各期存活的數(shù)量，P表示變態(tài)為仔蝦的數(shù)量;且從溞狀幼體到仔蝦各期分別賦予一個值，即 1、2、3、4、5、6、7，表示幼體的發(fā)育階段。

幼體存活率(SR) 根據(jù)文獻［22］計算幼體存活率，表示幼體在各個發(fā)育階段的存活情況，計算公式如下:

式中，Z1、Z2、…、Z6分別表示脊尾白蝦溞狀幼體各期存活的數(shù)量，P表示變態(tài)為仔蝦的數(shù)量，20為放入幼體的初始數(shù)量。

1.2.4 個體干質(zhì)量的測定

出現(xiàn)仔蝦的第一天，從每個燒杯中取出3—5只仔蝦放在20目的濾網(wǎng)上，用自來水沖洗后，用濾紙吸干水分，轉(zhuǎn)移到已稱重的錫箔制成的小杯子里，然后放入電熱鼓風干燥箱內(nèi)，在60℃下烘干6 h。烘干后在萬分之一的電子天平上稱量樣品和杯子總重。仔蝦個體干質(zhì)量計算公式如下:

1.2.5 有效積溫的計算

脊尾白蝦受精卵孵化有效積溫可通過以下雙曲線公式計算［23-24］:

式中，K為脊尾白蝦受精卵完成發(fā)育所需要的有效積溫(時度，℃·h);N為發(fā)育歷期，即孵化出溞狀幼體所需要的時間(h);T為發(fā)育期的平均溫度(℃);C為發(fā)育起點溫度，即生物學零度(℃)。

將方程(1)可轉(zhuǎn)換成:

式中，V為發(fā)育所需要時間的倒數(shù)(1/N)，即發(fā)育速度。

在 n 種實驗溫度(T1、T2、T3、…、Tn)下，分別觀察和記錄相應的發(fā)育時間 N1、N2、N3、…、Nn，將 N1、N2、N3、…、Nn換算成 V1、V2、V3、…、Vn，根據(jù)以下公式便可求出 C 和 K 值［24］。

1.2.6 顯著性檢驗

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS軟件統(tǒng)計分析。所有組間數(shù)據(jù)在進行顯著性差異比較之前都用Kolmogorov-Smirnow Test在5%水平下檢驗均勻性。如果均勻性不好，則將數(shù)據(jù)化為對數(shù)或平方根后再用單因子方差分析(one way ANOVA)進行比較，Duncan multiple range test用來檢驗顯著性差異(P＜0.05)。結(jié)果為百分數(shù)的先化為小數(shù)，然后開平方再轉(zhuǎn)換成反正弦函數(shù)做統(tǒng)計分析。

2 實驗結(jié)果

2.1 不同溫度對脊尾白蝦胚胎發(fā)育的影響

脊尾白蝦胚胎發(fā)育時間或發(fā)育速度與溫度的關(guān)系如表2，由表2數(shù)據(jù)可得到脊尾白蝦胚胎發(fā)育的生物學零度和有效積溫分別為12.18℃、3828.27℃·h。在15.3—28.1℃范圍內(nèi)胚胎發(fā)育時間隨著溫度的升高而呈雙曲線性縮短，其關(guān)系可用一冪函數(shù)方程H=570880T－2.3434(R2=0.9906)表示(圖1)，胚胎發(fā)育速度隨著溫度的升高而呈直線性加快(圖1)。但當溫度超過30℃時，胚胎發(fā)育受到抑制，受精卵大部分脫離母體腹部，不能順利孵化出溞狀幼體。

表2 脊尾白蝦胚胎發(fā)育時間與溫度的關(guān)系Table 2 Relationship between development time and water temperature in the embryonic development of Exopalaemon carinicauda

2.2 不同溫度對脊尾白蝦幼體變態(tài)發(fā)育的影響

各溫度組幼體發(fā)育指數(shù)如表3所示，從孵化后第2天開始，不同溫度組間就呈現(xiàn)出一定的差異，26℃和28℃組變態(tài)發(fā)育最快，均顯著快于其它組(P＜0.05)。幼體孵化后第15天時，22℃和24℃兩組發(fā)育指數(shù)均高于6.90，顯著高于 18℃和 20℃兩組(P＜0.05)。18—28℃各組開始出現(xiàn)仔蝦的時間依次為17、14、11、9、8、8d，各組90%以上幼體變態(tài)為仔蝦的時間依次為21、18、15、14、11、11d。

2.3 不同溫度對脊尾白蝦幼體發(fā)育成活率的影響

不同組別的幼體在實驗期間的存活率見表4，各實驗組在變態(tài)過程中存活率都呈明顯的階梯式下降趨勢，其中T28組的存活率下降最快。到各組幼體全部變?yōu)樽形r時，T24組的存活率最高為92.00%，其次為T18、T22和 T26的88.00%，T20為 86.67%，T28組存活率最低為85.11%，但6組間的存活率無顯著性差異(P＞0.05)。

2.4 不同溫度對脊尾白蝦仔蝦體質(zhì)量的影響

不同實驗組仔蝦個體干質(zhì)量見圖2，T18仔蝦的干質(zhì)量最大為 0.85 mg，與其它組差異顯著(P＜0.05);T20—T28各組仔蝦的干質(zhì)量分別為 0.62、0.67、0.64、0.56和0.51 mg，T28仔蝦的干質(zhì)量最小，但該5組間無顯著性差異(P＞0.05)。

圖1 胚胎發(fā)育時間及其發(fā)育速度與溫度的關(guān)系Fig.1 Relationship between time or rate and mean water temperature for embryonic development of Exopalaemon carinicauda

表3 不同溫度下脊尾白蝦幼體發(fā)育指數(shù)Table 3 Effect of temperature on the larval stage index of Exopalaemon carinicauda

表4 不同溫度下脊尾白蝦幼體存活率Table 4 Effect of temperature on the survival rate of larvae of Exopalaemon carinicauda

3 討論

3.1 脊尾白蝦胚胎發(fā)育生物學零度和有效積溫

脊尾白蝦屬于抱卵繁殖，當受精卵粘附在母體腹肢后，母體已不再向受精卵輸送營養(yǎng)，而鹽度、溫度、溶氧、pH值、重金屬等環(huán)境因子則對胚胎發(fā)育有著重要的影響，因此在脊尾白蝦育苗當中，應注重對水體環(huán)境因子的調(diào)控，特別是對溫度的調(diào)控，對胚胎發(fā)育速度有著決定性作用。探明其胚胎發(fā)育的生物學零度及有效積溫，可為人工控制幼體孵化提供理論依據(jù)，有計劃地安排生產(chǎn)。本實驗得到的脊尾白蝦胚胎發(fā)育生物學零度為12.18 ℃，王桂忠等［25-27］研究得出東方扁蝦(Thenus orientalis)、銹斑蟳(Charybdis feriatus)和擬穴青蟹胚胎發(fā)育的生物學零度分別為13.50、15.68℃和15.70℃，稍高于脊尾白蝦;而呂佳等［18，28］報道克氏原螯蝦和鋸緣青蟹胚胎發(fā)育的生物學零度分別為5.60℃和11.70℃，稍低于脊尾白蝦。這可能由于不同物種生活環(huán)境不同，繁殖季節(jié)對水溫要求不同所致。脊尾白蝦主要生活在淺海水域，其繁殖盛期在5—8月份，水溫為12.5—26.8℃［2］，本實驗得到的脊尾白蝦胚胎發(fā)育生物學零度稍低于自然海區(qū)的水溫，符合發(fā)育生物學的規(guī)律。因此在脊尾白蝦育苗當中，受精卵孵化水溫應不低于12.18℃，否則將影響其正常發(fā)育。在其他水質(zhì)條件滿足的前提下，脊尾白蝦胚胎發(fā)育直至幼體孵化的有效積溫是一定的，即一常數(shù)。本研究根據(jù)昆蟲發(fā)生期預測的有效積溫法，首次得出脊尾白蝦胚胎發(fā)育理論有效積溫為3828.27℃·h，可在一定范圍內(nèi)有效預測脊尾白蝦胚胎完成整個發(fā)育周期所需的時間。

圖2 不同溫度下仔蝦個體干質(zhì)量Fig.2 Effect of temperature on the individual dry weight of the post-larva of Exopalaemon carinicauda

3.2 脊尾白蝦胚胎發(fā)育與溫度的關(guān)系

對變溫動物而言，溫度的高低對胚胎發(fā)育的速度有很大影響。在一定范圍內(nèi)，胚胎發(fā)育速度與溫度的高低成正比，即溫度越高，發(fā)育越快;溫度越低，發(fā)育越慢［29］。本實驗在水溫15—28℃條件下，脊尾白蝦受精卵隨著孵化溫度的升高，孵化時間逐漸縮短，這與長毛對蝦、紅螯光殼螯蝦、日本沼蝦、鋸緣青蟹、克氏原螯蝦等［16-17，28，30-31］受精卵孵化所需時間與溫度呈一定的函數(shù)關(guān)系結(jié)論一致。本實驗發(fā)現(xiàn)當孵化溫度超過30℃時脊尾白蝦受精卵大部分脫落于水體中，不能順利孵化出幼體。如日本沼蝦［30］在34℃時胚胎發(fā)育時間有延長趨勢，而且在36℃時胚胎不能完成整個發(fā)育期;長毛對蝦［16］在超過35.5℃時受精卵孵化受到抑制;東方扁蝦［25］胚胎在34℃時離體培養(yǎng)，2—3 d后即表現(xiàn)出不適，約一周后呈解體狀，在37℃培養(yǎng)1—2 d后即全呈解體狀。說明每種蝦的胚胎發(fā)育都有一個溫度耐受范圍，而這一范圍一般小于其存活的適溫范圍，當水體溫度超出其胚胎耐受范圍時，胚胎發(fā)育將受到抑制，這可能是由于高溫度導致胚胎內(nèi)某些酶的活性喪失或被抑制，從而造成新陳代謝的紊亂，最終使胚胎死亡［30］，也可能是由于高溫使脊尾白蝦抱卵剛毛粘附性受到了影響，卵之間的卵柄連接變?nèi)踔敝练蛛x，散落于水體底部后失去了母體腹肢攪動水體供氧途徑，最終因缺氧無法進行新陳代謝而死亡，但具體原因仍需進一步深入研究。

蝦蟹類胚胎發(fā)育是一個動態(tài)的生理生化變化過程。卵黃物質(zhì)作為胚胎發(fā)育的主要營養(yǎng)來源，其水解形成的蛋白質(zhì)和氨基酸，一方面為胚胎生理代謝提供能量，另一方面為胚胎組織器官的形成提供必需的物質(zhì)［32］。研究顯示，卵黃蛋白在羅氏沼蝦、日本沼蝦、紅螯光殼螯蝦、中華絨螯蟹和鋸緣青蟹等胚胎發(fā)育過程中總體呈直線下降趨勢，而氨基酸呈拋物線下降趨勢，但隨著胚胎的發(fā)育能量消耗卻顯著增加，這也說明卵黃物質(zhì)不斷進行著異化和同化作用，一部分為胚胎發(fā)育提供能量，另一部分則用于組織分化和器官的形成［32-35］，Babu［36］認為蛋白質(zhì)尤其在角質(zhì)層、肌肉、消化和神經(jīng)系統(tǒng)形成中發(fā)揮著重要作用。

而在胚胎發(fā)育過程中，卵黃物質(zhì)的分解和利用與各種酶類密切相關(guān)，是通過各種消化酶的水解作用為胚胎發(fā)育提供能量和構(gòu)建胚胎組織、器官［37］。研究表明，胃蛋白酶、類胰蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶和脂酶在蝦蟹胚胎各個時期均有活性，而且酶的活性高低與蛋白質(zhì)含量的變化呈一定的相關(guān)性［34，37］。然而這一系列反應過程通常需要適宜的溫度條件，溫度對于胚胎發(fā)育過程中各種酶活的影響，將直接影響到營養(yǎng)物質(zhì)的同化和異化作用速率，從而影響孵化時間。作者推測，在脊尾白蝦胚胎發(fā)育中同樣也存在著在各種酶催化作用下所發(fā)生的一系列反應，而在不同溫度下酶促反應速率也不同，從而表現(xiàn)出胚胎發(fā)育速率的差異。

3.3 脊尾白蝦幼體變態(tài)發(fā)育與溫度的關(guān)系

蝦蟹幼體發(fā)育一個階段則經(jīng)歷一次蛻皮，而其蛻皮主要是受內(nèi)分泌激素如蛻皮激素和蛻皮抑制激素等共同作用的結(jié)果［38］，其中膽固醇是蛻皮激素生物合成中一種重要的前體物，研究發(fā)現(xiàn)真蟹蛻皮時Y-器官對膽固醇的含量大大增加，黃道蟹蛻皮前后血液中的膽固醇活性也顯著增加［39］。但從膽固醇到蛻皮激素的轉(zhuǎn)化是一系列復雜的生化反應，主要是在細胞色素P450(CYP450)酶的催化作用下最終合成蛻皮激素，然后再與蛻皮激素受體結(jié)合，在熱休克蛋白90(HSP90)、熱休克蛋白70(HSP70)和蛻皮激素誘導因子E75等分子伴侶蛋白的協(xié)同下級聯(lián)放大蛻皮信號，最終促進蛻皮［40-42］。因甲殼動物自身不能合成膽固醇，所以必須從外界攝取足夠的膽固醇才能保證正常變態(tài)發(fā)育［43］，本實驗中脊尾白蝦幼體餌料為鹵蟲無節(jié)幼體，富含膽固醇［44］，因此在脊尾白蝦幼體攝取足夠膽固醇的條件下，隨著溫度的升高，CYP450酶的活性也隨之增強，從而增加了膽固醇轉(zhuǎn)化為蛻皮激素的效率，同時在較高溫度下HSP90等蛋白協(xié)同作用增強，加速了對蛻皮信號的傳遞、放大，從而表現(xiàn)出蛻皮頻率的加快。

幼體蛻皮過程也是物質(zhì)能量消耗的過程，幼體從攝食餌料中積累能量和重要營養(yǎng)物質(zhì)是與蛻皮周期內(nèi)分泌調(diào)控相互作用的一個重要外源因子［38］，Anger和Dawirs［45］提出幼體能進入蛻皮周期的某一點，關(guān)鍵在于幼體已積累了足夠的能量或營養(yǎng)。因此在蛻皮前需積累一定的營養(yǎng)物質(zhì)，而營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用與各種消化酶密切相關(guān)，消化酶活力的高低決定著幼體對營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收能力，從而影響幼體生長發(fā)育速度［15］。在蝦蟹類幼體中普遍存在胃蛋白酶、類胰蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶和脂肪酶5種消化酶，而這些酶活力與溫度有直接的關(guān)系，酶活力的適宜溫度也正是幼體生長發(fā)育的適宜溫度［46-49］。潘魯青［15］報道在22—25℃，中國對蝦溞狀幼體胃蛋白酶、類胰蛋白酶和淀粉酶3種酶的活力較高，因此選擇此溫度為中國對蝦溞狀幼體培育的最佳溫度。本實驗結(jié)果表明，在一定溫度范圍內(nèi)脊尾白蝦幼體的變態(tài)發(fā)育速度隨著溫度的升高而加快，與潘魯青、施流章、邢克智、Villarreal和Kumlu［15-16，50-52］等研究結(jié)果一致。但當超出26℃時，脊尾白蝦幼體的發(fā)育速度已不再加快，而22℃時的發(fā)育速度明顯快于18℃和20℃，這可能是由于22—26℃是幼體體內(nèi)消化酶最適宜的溫度，加快了幼體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，為幼體變態(tài)發(fā)育提供了足夠的物質(zhì)能量。因此建議脊尾白蝦幼體培育最佳溫度控制在22—26℃。

3.4 脊尾白蝦仔蝦存活率和個體質(zhì)量與溫度的關(guān)系

在本實驗條件下，隨著幼體發(fā)育，成活率成階梯式下降，說明幼體死亡率主要發(fā)生在幼體蛻皮時期，因每次蛻皮前后幼體形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生了質(zhì)的變化，因此也是死亡率高峰期，但各組幼體全部變?yōu)樽形r時的存活率無顯著性差異，這也說明隨著溫度的升高只是加快了幼體發(fā)育速度。到各溫度組全部幼體變?yōu)樽形r時，18℃組仔蝦的個體干質(zhì)量最大，這可能是由于幼體從外界攝取一定數(shù)量的能量后，首先用于滿足蛻皮需要的蛻皮能，更多的食物能量攝取才用于攝食后的生長［53］，而在較低溫度下幼體變態(tài)間隔時間較長，因此在其體內(nèi)儲存了更多的營養(yǎng)物質(zhì)而用于生長。

4 小結(jié)

實驗結(jié)果表明，脊尾白蝦胚胎發(fā)育的生物學零度為12.18℃，有效積溫為3828.27℃·h。胚胎在15—28℃均能順利孵化出幼體，約需41—10 d，溫度越高孵化所需時間越短，但最高不應超高過30℃;脊尾白蝦溞狀幼體在18—28℃均能順利變態(tài)到仔蝦，結(jié)合發(fā)育速度和存活率等指標綜合考慮，建議最佳培育溫度控制在22—26℃。

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