周佳宇，賈 永，王宏偉，戴傳超

(南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇省微生物與功能基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省微生物資源產(chǎn)業(yè)化工程技術(shù)研究中心，南京 210023)

茅蒼術(shù)(Atractylodes lancea(Thunb.)DC.)為菊科蒼術(shù)屬多年生草本植物，其干燥根莖為著名藥材蒼術(shù)。江蘇省茅山地區(qū)為茅蒼術(shù)道地產(chǎn)區(qū)，由于近年來(lái)掠奪性的采挖，加之生境破壞嚴(yán)重，茅蒼術(shù)資源面臨瀕危和枯竭［1］。目前，茅蒼術(shù)藥材基本來(lái)自人工栽培，因此，研究影響茅蒼術(shù)活性成分積累和配比的因素對(duì)高質(zhì)量茅蒼術(shù)藥材的栽培和生產(chǎn)至關(guān)重要［2］。一些植物內(nèi)生菌與宿主植物長(zhǎng)期共存、協(xié)同進(jìn)化。茅蒼術(shù)體內(nèi)高揮發(fā)油含量的特殊環(huán)境使其蘊(yùn)含有獨(dú)特的內(nèi)生菌資源，而內(nèi)生菌也能夠影響茅蒼術(shù)的生長(zhǎng)發(fā)育及其藥用活性成分的組成和積累［3］。一些內(nèi)生真菌能夠促進(jìn)茅蒼術(shù)組培苗的生長(zhǎng)，增強(qiáng)其對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性，提高其成活率［4］。

由于茅蒼術(shù)葉片是揮發(fā)油合成的主要部位，且其中的內(nèi)生細(xì)菌尚無(wú)相關(guān)研究，本文探究了茅蒼術(shù)葉片中可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的多樣性及其固氮、解磷、解鉀和產(chǎn)生長(zhǎng)素的能力。通過(guò)本研究篩選得到一些具有植物促生潛力的茅蒼術(shù)內(nèi)生細(xì)菌資源，初步揭示了內(nèi)生細(xì)菌與茅蒼術(shù)之間的相互關(guān)系，為進(jìn)一步將內(nèi)生細(xì)菌回接茅蒼術(shù)植株，增加茅蒼術(shù)藥材的產(chǎn)量和藥理活性物質(zhì)的積累提供了重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物來(lái)源與內(nèi)生細(xì)菌的分離

多年生茅蒼術(shù)植株100株來(lái)源于茅蒼術(shù)道地產(chǎn)區(qū)江蘇省茅山地區(qū)九龍藥材公司茅蒼術(shù)藥材種植園，移栽至南京師范大學(xué)植物園生長(zhǎng)超過(guò)2a，長(zhǎng)勢(shì)良好、無(wú)病蟲害。2011年秋季，隨機(jī)挑選20株花果期健康的茅蒼術(shù)植株并摘取其完整的中上部葉片，共20片。

茅蒼術(shù)葉片經(jīng)自來(lái)水和雙蒸水分別清洗后，用70%乙醇消毒1 min，0.1%升汞消毒10 min，無(wú)菌水沖洗多次［4］，研磨后分別涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和Luria Bertani(LB)培養(yǎng)基上，同時(shí)也分別涂布最后一次洗滌液，作為葉片表面滅菌徹底的對(duì)照。涂布好的培養(yǎng)基于30℃培養(yǎng)，待有菌落形成時(shí)，依據(jù)菌落形態(tài)的差異，分別挑取不同的內(nèi)生細(xì)菌單菌落，純化后于LB斜面上4℃保藏。主要依據(jù)的形態(tài)特征有:菌落大小、菌落形狀、菌落邊緣是否齊整、菌落顏色、菌落透明度、菌落光澤度以及菌落表面是否光滑、是否存在特殊結(jié)構(gòu)。

1.2 茅蒼術(shù)內(nèi)生細(xì)菌的多樣性分析

使用通用引物27F和1492R［5］，采用菌液PCR對(duì)分離得到的茅蒼術(shù)內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行16S rDNA片段的擴(kuò)增。擴(kuò)增后獲得大小在1500 bp左右的片段，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)合格后進(jìn)行核糖體DNA擴(kuò)增片段限制性內(nèi)切酶分析(ARDRA)。

將一部分16S rDNA片段擴(kuò)增產(chǎn)物使用限制性內(nèi)切酶HaeⅢ和AluⅠ在37℃下分別消化4 h，用3%瓊脂糖凝膠120 V電泳后紫外成像并拍照。使用GelcomparⅡ軟件［6］對(duì)獲得的限制性片段多態(tài)性圖譜進(jìn)行UPGMA 聚類分析［7］。

在各ARDRA聚類簇中挑選代表菌株，對(duì)其16S rDNA片段進(jìn)行測(cè)序。序列測(cè)定委托北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行，測(cè)序引物與擴(kuò)增相同，PCR產(chǎn)物直接測(cè)通。測(cè)序結(jié)果在Genbank中進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，推測(cè)其分類地位。

對(duì)主要ARDRA聚類簇中的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行BOX-PCR分析。BOX-PCR產(chǎn)物經(jīng)上述凝膠電泳、成像、拍照和聚類分析后，得到主要ARDRA聚類簇中內(nèi)生細(xì)菌的聚類分析圖，研究聚類簇水平上內(nèi)生細(xì)菌的多樣性［8］。BOX-PCR采用通用引物BOX A1R［9］，50 μL反應(yīng)體系，擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性1 min，45℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán);72℃延伸6 min。

1.3 茅蒼術(shù)內(nèi)生細(xì)菌促生潛力的分析

1.3.1 內(nèi)生細(xì)菌固氮能力的測(cè)定

能夠在Burk's無(wú)氮培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)的內(nèi)生細(xì)菌菌株具有固氮潛力［10］。提取具固氮潛力的內(nèi)生細(xì)菌的總DNA，使用引物nifH-F和nifH-R［11］擴(kuò)增其nifH基因，能夠獲得大小在450 bp左右條帶的內(nèi)生細(xì)菌含有nifH基因［12］。并對(duì)其16S rDNA片段進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序，在Genbank中進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)后，獲得相似菌株的序列，Clustal X多重比對(duì)后，使用Mega 5.0軟件，采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，對(duì)各固氮菌株的系統(tǒng)發(fā)生地位進(jìn)行分析，Bootstrap 1000次檢驗(yàn)各分支的置信值。

1.3.2 內(nèi)生細(xì)菌解磷能力的測(cè)定

將內(nèi)生細(xì)菌分別接種于National Botanical Research Institute Phosphate(NBRIP)培養(yǎng)基［13］和蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基［14］上后，通過(guò)觀察是否有溶磷圈的形成來(lái)確定其是否具有溶解無(wú)機(jī)磷或有機(jī)磷的能力。進(jìn)一步通過(guò)鉬銻抗比色法定量測(cè)定細(xì)菌溶解無(wú)機(jī)磷或有機(jī)磷的能力［15］，同時(shí)測(cè)定菌液的pH值。

鉬銻抗比色法的具體步驟如下:將OD600調(diào)節(jié)一致的茅蒼術(shù)內(nèi)生細(xì)菌懸液1 mL接種于35 mL NBRIP液體培養(yǎng)基或蒙金娜有機(jī)磷液體培養(yǎng)基中。30℃，220 r/min培養(yǎng)7 d后8000 r/min離心10 min，取1 mL上清液于50 mL容量瓶中，加入鉬銻抗混合顯色劑5 mL后加水定容至刻度，靜置30 min后，于660 nm測(cè)定吸光值。吸光值帶入磷酸二氫鉀標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.007x+0.026，R2=0.997即可計(jì)算得到發(fā)酵液中可溶性磷元素的含量［15］。每個(gè)樣品3次重復(fù)。

1.3.3 內(nèi)生細(xì)菌解鉀能力的測(cè)定

內(nèi)生細(xì)菌的解鉀能力使用添加鉀長(zhǎng)石粉作為唯一鉀源的硅酸鹽培養(yǎng)基進(jìn)行檢測(cè)。將內(nèi)生細(xì)菌分別接種于硅酸鹽培養(yǎng)基上，于30℃培養(yǎng)10 d后觀察，能夠生長(zhǎng)的菌株具有解鉀潛力［16］。每個(gè)樣品3次重復(fù)。

1.3.4 內(nèi)生細(xì)菌產(chǎn)生長(zhǎng)素能力的測(cè)定

將OD600調(diào)節(jié)一致的茅蒼術(shù)內(nèi)生細(xì)菌懸液1 mL接種于含5 mmol/L L-色氨酸的25 mL LB培養(yǎng)基中。220 r/min，30℃，避光培養(yǎng)48 h后，8000 r/min離心10 min，取1 mL上清液與2 mL Salkowski試劑混勻后于黑暗處室溫溫育30 min，使用分光光度計(jì)于530 nm處檢測(cè)其吸光值，帶入吲哚乙酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出菌株48 h的生長(zhǎng)素產(chǎn)生量［17］。每個(gè)樣品3次重復(fù)。生長(zhǎng)素標(biāo)準(zhǔn)曲線使用已知的吲哚乙酸濃度分別在0—60 μg/mL和60—300 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液顯色后在530 nm處的吸光值分別進(jìn)行擬合［18］。生長(zhǎng)素標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為y=0.002x－0.001，R2=0.997(0—60 μg/mL)和 y=0.003x－0.079，R2=0.999(60—300 μg/mL)。

1.4 數(shù)據(jù)及圖譜分析

使用Excel軟件計(jì)算各菌株測(cè)定指標(biāo)不同重復(fù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，并繪制圖形。ARDRA和BOX-PCR指紋圖譜分析使用GelcomparⅡ軟件。系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建使用Mega 5.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 茅蒼術(shù)內(nèi)生細(xì)菌的分離

依據(jù)單菌落形態(tài)的差異，從茅蒼術(shù)葉片中分離得到52株可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌，其中7株在傳代培養(yǎng)過(guò)程中停止生長(zhǎng)，不納入實(shí)驗(yàn)范圍。對(duì)可正常傳代培養(yǎng)的45株內(nèi)生細(xì)菌分別編號(hào)為ALEB 1B、ALEB 2A、ALEB 2B、ALEB 3A、ALEB 3B、ALEB 4A、ALEB 5A、ALEB 5B、ALEB 6B、ALEB 7A、ALEB 7B、ALEB 8、ALEB 10、ALEB 11、ALEB 13—ALEB 15、ALEB 19—ALEB 22、ALEB 24—ALEB 47。

2.2 茅蒼術(shù)內(nèi)生細(xì)菌的多樣性分析2.2.1 內(nèi)生細(xì)菌的ARDRA分析

45株茅蒼術(shù)內(nèi)生細(xì)菌的限制性片段多態(tài)性圖譜經(jīng)UPGMA聚類分析后，以60%的相似度為標(biāo)準(zhǔn)劃分為14個(gè)聚類簇(圖1)。各聚類簇中代表菌株的16S rDNA全序列測(cè)定結(jié)果經(jīng)Genbank同源性比對(duì)后，確定其可能的分類學(xué)地位(表1)。

表1 茅蒼術(shù)葉片可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌ARDRA聚類簇Table 1 ARDRA clusters of the culturable endophytic bacteria from the leaves of Atractylodes lancea

2.2.2 主要ARDRA聚類簇內(nèi)的BOX-PCR分析

在ARDRA聚類簇水平上使用BOX-PCR獲得的指紋圖譜對(duì)茅蒼術(shù)內(nèi)生細(xì)菌主要聚類簇6和9進(jìn)行細(xì)分，并進(jìn)行UPGMA聚類分析(圖2)。聚類簇6中的11株內(nèi)生細(xì)菌中親緣關(guān)系最近的菌株ALEB 6B和ALEB 11及ALEB 7A和ALEB 7B的相似度為95%;聚類簇9中親緣關(guān)系最近的菌株ALEB 40和ALEB 43的相似度為92%。說(shuō)明相同茅蒼術(shù)內(nèi)生細(xì)菌ARDRA聚類簇中的菌株具有豐富的多樣性，應(yīng)屬于同一屬的不同種或同一種的不同菌株。BOX-PCR指紋圖譜的分析結(jié)果也表明茅蒼術(shù)體內(nèi)蘊(yùn)藏著豐富的內(nèi)生細(xì)菌資源。

2.3 茅蒼術(shù)內(nèi)生細(xì)菌促生潛力的篩選

45株茅蒼術(shù)內(nèi)生細(xì)菌中有10株能夠在Burk's無(wú)氮培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，表明其具有固氮潛力。分別有19株和15株內(nèi)生細(xì)菌具有溶解無(wú)機(jī)磷和有機(jī)磷的能力。有24株茅蒼術(shù)內(nèi)生細(xì)菌能夠在硅酸鹽培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，具有解鉀潛力。其中ALEB 5A、ALEB 13和ALEB 35同時(shí)具有固氮、溶解有機(jī)磷和解鉀的能力，ALEB 14和ALEB 47同時(shí)具有固氮、溶解無(wú)機(jī)磷和解鉀的能力，ALEB 11、ALEB 27、ALEB 29和ALEB 37同時(shí)具有溶解無(wú)機(jī)磷和有機(jī)磷的能力，但并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)同時(shí)具有固氮、溶解無(wú)機(jī)磷和有機(jī)磷、解鉀和產(chǎn)生長(zhǎng)素能力的內(nèi)生細(xì)菌菌株。

圖1 茅蒼術(shù)內(nèi)生細(xì)菌限制性內(nèi)切酶酶切指紋圖譜聚類分析Fig.1 Fingerprints and dendrogram of 45 endophytic bacteria based on ARDRA

45株茅蒼術(shù)內(nèi)生細(xì)菌中有43株具有生長(zhǎng)素產(chǎn)生能力，其中ALEB 44產(chǎn)生長(zhǎng)素的能力最強(qiáng)，在30℃，220 r/min培養(yǎng)48 h后的生長(zhǎng)素產(chǎn)生量達(dá)到(268.44±10.12)μg/mL。有25株內(nèi)生細(xì)菌的生長(zhǎng)素產(chǎn)生量高于 100 μg/mL。

2.4 茅蒼術(shù)內(nèi)生固氮細(xì)菌nifH基因的擴(kuò)增與16S r DNA的序列測(cè)定

2.4.1 茅蒼術(shù)內(nèi)生固氮細(xì)菌nifH基因的擴(kuò)增

對(duì)茅蒼術(shù)內(nèi)生固氮細(xì)菌的nifH基因片段進(jìn)行擴(kuò)增后，ALEB 5A、ALEB 5B、ALEB 13、ALEB 14、ALEB 26、ALEB 35、ALEB 39、ALEB41和ALEB 47能夠獲得大小在450 bp左右的目的條帶，表明這9株內(nèi)生細(xì)菌中含有nifH基因［11］。而ALEB 33在450 bp處并沒(méi)有條帶，其可能通過(guò)其它途徑獲得生長(zhǎng)所需的氮元素。結(jié)合ARDRA聚類分析的結(jié)果，有近1/2的聚類簇中包含有具固氮潛力的茅蒼術(shù)內(nèi)生細(xì)菌，其中ALEB 26屬于聚類簇1，ALEB 47屬于聚類簇3，ALEB 14屬于聚類簇4，ALEB 5A、ALEB 5B和ALEB 13屬于聚類簇5，ALEB 35屬于聚類簇8，ALEB 33和ALEB 39屬于聚類簇9，ALEB 41屬于聚類簇10。

圖2 聚類簇6和聚類簇9中內(nèi)生細(xì)菌BOX-PCR指紋圖譜聚類分析Fig.2 Fingerprints and dendrogram of endophytic bacteria from ARDRA cluster 6 and 9 based on BOX-PCR

表2 茅蒼術(shù)內(nèi)生細(xì)菌促生潛力的篩選Table 2 Plant growth-promoting potential of endophytic bacteria

續(xù)表

2.4.2 茅蒼術(shù)內(nèi)生固氮細(xì)菌16S rDNA序列的測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

以10株具固氮潛力的茅蒼術(shù)內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA基因?yàn)榛A(chǔ)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)表明ALEB 5A、ALEB 5B和ALEB 13與土壤桿菌屬的典型菌株聚在相同位置，ALEB 14和ALEB 26與泛菌屬的典型菌株聚在相同位置，ALEB 33、ALEB 39和ALEB 41與假單胞菌屬的典型菌株聚在相同位置，ALEB 35與芽孢桿菌屬的典型菌株聚在相同位置，ALEB 47與短小桿菌屬的典型菌株聚在相同位置。

2.5 茅蒼術(shù)內(nèi)生細(xì)菌溶解無(wú)機(jī)磷的定量檢測(cè)及細(xì)菌發(fā)酵液pH值的測(cè)定

結(jié)合菌液中可溶性磷元素的含量和pH值進(jìn)行分析(圖5)。ALEB 43發(fā)酵液中可溶性磷元素的含量最高，達(dá)(251.43±4.16)mg/L，并且其 pH 值(pH=4.16)與不接菌的培養(yǎng)基(pH=6.90)相比明顯下降。ALEB 3A、ALEB 7A、ALEB 7B、ALEB 21、ALEB 29和ALEB 47發(fā)酵液中可溶性磷元素的含量均大于100 mg/L，并且其發(fā)酵液的pH值均低于5.00。但ALEB 14和ALEB 20發(fā)酵液的pH值分別為4.62和4.53，其發(fā)酵液中可溶性磷元素的含量卻較低，僅為(46.67±6.55)mg/L 和(60.95±21.33)mg/L。而 ALEB 2A、ALEB 31 和ALEB 34的溶磷量均超過(guò)了150 mg/L，但其發(fā)酵液的pH值卻均高于6.00。

2.6 茅蒼術(shù)內(nèi)生細(xì)菌溶解有機(jī)磷的定量檢測(cè)及細(xì)菌發(fā)酵液pH值的測(cè)定

茅蒼術(shù)內(nèi)生細(xì)菌中具溶解有機(jī)磷能力的菌株數(shù)要低于具溶解無(wú)機(jī)磷能力的菌株數(shù)，并且磷元素的釋放量也較低，2/3解有機(jī)磷菌株的磷元素釋放量低于5 mg/L。ALEB 4A溶解有機(jī)磷的能力最強(qiáng)，磷元素釋放量為(23.63±1.46)mg/L。同時(shí)測(cè)定菌液的 pH 值(圖6)。

3 討論

3.1 茅蒼術(shù)內(nèi)生細(xì)菌多樣性

圖3 茅蒼術(shù)內(nèi)生固氮細(xì)菌nifH基因的擴(kuò)增Fig.3 Amplification of nifH genes from nitrogen-fixing endophytic bacteria

圖4 茅蒼術(shù)內(nèi)生固氮細(xì)菌16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic dendrogram of the nitrogen-fixing endophytic bacteria from Atractylodes lancea based on the 16S rDNA fragments

本課題組的前期研究已經(jīng)證明茅蒼術(shù)體內(nèi)存在豐富的內(nèi)生真菌資源，并且其對(duì)茅蒼術(shù)的生長(zhǎng)和道地性的形成產(chǎn)生了很大影響。本研究通過(guò)ARDRA和BOXPCR相結(jié)合的方法揭示了茅蒼術(shù)內(nèi)生細(xì)菌的多樣性。ARDRA是一種簡(jiǎn)單而可靠的細(xì)菌分類方法［19］，能夠在16S rDNA片段的基礎(chǔ)上估計(jì)分離物中存在的最低限度的細(xì)菌種類數(shù)目［20］。許多研究者將ARDRA應(yīng)用于不同來(lái)源細(xì)菌的初步分類與鑒定［8，21］。本研究中的14個(gè)ARDRA聚類簇代表菌株的16S rDNA序列測(cè)定結(jié)果表明分離得到的茅蒼術(shù)內(nèi)生細(xì)菌與泛菌屬、微桿菌屬、短桿菌屬、農(nóng)桿菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬細(xì)菌親緣關(guān)系相近，其中茅蒼術(shù)葉片優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌與假單胞菌屬細(xì)菌親緣關(guān)系相近。這些屬的細(xì)菌均已被報(bào)道作為內(nèi)生細(xì)菌存在于不同植物體內(nèi)，其中一些還具有植物促生能力［22-25］。與ARDRA相比，使用BOX-PCR獲得的指紋圖譜能夠區(qū)分親緣關(guān)系更近的細(xì)菌菌株［26］，因此利用BOX-PCR對(duì)茅蒼術(shù)內(nèi)生細(xì)菌主要ARDRA聚類簇6和9中的菌株進(jìn)行分析。BOX-PCR指紋圖譜聚類分析結(jié)果表明，主要ARDRA聚類簇中的內(nèi)生細(xì)菌菌株也具有豐富的多樣性。

圖5 茅蒼術(shù)內(nèi)生細(xì)菌無(wú)機(jī)磷溶解量與發(fā)酵液pH值Fig.5 The amountofdissociative phosphorusreleased by inorganic phosphate solubilizing bacteria and the pH oftheir fermentation solutions

圖6 茅蒼術(shù)內(nèi)生細(xì)菌有機(jī)磷溶解量與發(fā)酵液pH值Fig.6 The amount of dissociative phosphorus released by organic phosphate solubilizing bacteria and the pH of their fermentation solutions

3.2 茅蒼術(shù)內(nèi)生細(xì)菌的促生潛力

氮、磷、鉀是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中不可缺少的重要營(yíng)養(yǎng)元素。在作物生長(zhǎng)過(guò)程中常需要人工施加氮、磷、鉀等肥料以滿足作物對(duì)養(yǎng)分的需求。本研究獲得了多株具有固氮、溶解無(wú)機(jī)磷或有機(jī)磷、解鉀和產(chǎn)生長(zhǎng)素能力的內(nèi)生細(xì)菌。如果這些具有多種促生潛力的內(nèi)生細(xì)菌菌株能夠與茅蒼術(shù)建立良好的共生關(guān)系，那么它們能夠?yàn)樗拗髦参锾峁└嗫杀焕玫牡⒘?、鉀元素和植物激素，這必然會(huì)對(duì)茅蒼術(shù)藥材的產(chǎn)量和品質(zhì)產(chǎn)生有益影響。但本實(shí)驗(yàn)中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)同時(shí)具有固氮、溶解無(wú)機(jī)磷和有機(jī)磷、解鉀和產(chǎn)生長(zhǎng)素能力的內(nèi)生細(xì)菌菌株，因此在生產(chǎn)實(shí)踐中可以將不同茅蒼術(shù)內(nèi)生細(xì)菌組合使用，使它們協(xié)同發(fā)揮促生功能，從一定程度上解決茅蒼術(shù)栽培過(guò)程中土壤營(yíng)養(yǎng)元素失衡的問(wèn)題，增加蒼術(shù)藥材的產(chǎn)量和品質(zhì)［27］。

依據(jù)16S rDNA序列測(cè)定結(jié)果構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，茅蒼術(shù)內(nèi)生固氮細(xì)菌分別與土壤桿菌屬、泛菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬和短小桿菌屬的典型菌株聚為一類，應(yīng)屬于這些屬的不同種或同一種的不同菌株，而這些屬的細(xì)菌均已被報(bào)道具有固氮能力［24，28-29］。但不同無(wú)氮培養(yǎng)基間存在一定的差異，使用某一種無(wú)氮培養(yǎng)基進(jìn)行固氮細(xì)菌的篩選不能夠得到所有具固氮潛力的細(xì)菌，茅蒼術(shù)體內(nèi)應(yīng)該還存在有其他種屬的固氮細(xì)菌有待于進(jìn)一步的發(fā)現(xiàn)與研究。

ARDRA聚類簇6中的9個(gè)菌株均具有溶解無(wú)機(jī)磷的能力，并且其溶磷量與產(chǎn)酸能力呈正相關(guān)。因此，推測(cè)部分茅蒼術(shù)內(nèi)生細(xì)菌通過(guò)分泌一些酸性物質(zhì)來(lái)溶解磷酸鈣，釋放難溶性的磷元素。但有些內(nèi)生細(xì)菌溶解無(wú)機(jī)磷的量很高，同時(shí)其菌液的pH值也較高。說(shuō)明分泌酸性物質(zhì)并不是內(nèi)生細(xì)菌溶解磷酸鹽的唯一途徑，這些菌株可能通過(guò)分泌胞外磷酸酶來(lái)釋放磷元素，并且不同的作用途徑間可能存在協(xié)同。除ALEB 14和ALEB 47外，其他具溶解無(wú)機(jī)磷能力的菌株都與假單胞菌屬菌株近緣，這與之前研究報(bào)道的假單胞菌屬細(xì)菌溶解無(wú)機(jī)磷的能力相符［30］。具有機(jī)磷溶解能力的內(nèi)生細(xì)菌菌株ALEB 10和ALEB 35經(jīng)16S rDNA序列測(cè)定、比對(duì)，與巨大芽孢桿菌的相似度分別為99%和98%。巨大芽孢桿菌為已知的解磷菌種，并已經(jīng)作為微生物菌劑廣泛使用［31］。細(xì)菌發(fā)酵液pH值的測(cè)定結(jié)果表明，內(nèi)生細(xì)菌溶解有機(jī)磷的能力與其產(chǎn)酸能力無(wú)相關(guān)性。因此推測(cè)茅蒼術(shù)內(nèi)生細(xì)菌通過(guò)分泌胞外磷酸酶來(lái)溶解卵磷脂，釋放磷元素。植物促生細(xì)菌在植物體外，通過(guò)釋放土壤中不溶性的磷元素，促進(jìn)植物生長(zhǎng)和次級(jí)代謝物積累的能力已有報(bào)道［32-33］。而植物內(nèi)生細(xì)菌很可能來(lái)源于土壤，通過(guò)植物根部的自然孔洞或傷口侵入植物體內(nèi)，成為植物體微生態(tài)體系的一部分，因此，可以利用內(nèi)生細(xì)菌在植物根際土壤中的定殖來(lái)改善植物的磷素營(yíng)養(yǎng)［34］。而具有解鉀潛力的內(nèi)生細(xì)菌幾乎分布于各ARDRA聚類簇，不具有種屬差異。

大多數(shù)茅蒼術(shù)內(nèi)生細(xì)菌能夠?qū)⑴囵B(yǎng)基中的L-色氨酸轉(zhuǎn)化為IAA，并將其分泌至體外。雖然培養(yǎng)時(shí)間以及色氨酸含量可能對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)素產(chǎn)生量存在一定影響，但從本實(shí)驗(yàn)獲得的結(jié)果可以看出很大一部分茅蒼術(shù)內(nèi)生細(xì)菌具有較強(qiáng)的IAA產(chǎn)生能力，并且部分菌株產(chǎn)生長(zhǎng)素的能力要大于一些實(shí)驗(yàn)者分離得到的其他來(lái)源的細(xì)菌菌株［17］。雖然本實(shí)驗(yàn)未對(duì)茅蒼術(shù)植株體內(nèi)色氨酸的含量進(jìn)行測(cè)定，但其作為植物合成IAA的前體物質(zhì)，應(yīng)當(dāng)在菊科高等植物茅蒼術(shù)中也廣泛存在。因此，作者推測(cè)內(nèi)生細(xì)菌在與茅蒼術(shù)建立共生后，可以利用植物體內(nèi)游離的色氨酸合成IAA，供宿主植物使用。

綜上所述，本研究首次探究了江蘇省道地藥材茅蒼術(shù)葉片內(nèi)可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的多樣性，并研究了其固氮、解磷、解鉀和產(chǎn)生長(zhǎng)素的促生潛力。初步揭示了內(nèi)生細(xì)菌與茅蒼術(shù)之間的相互關(guān)系，為進(jìn)一步將內(nèi)生細(xì)菌回接茅蒼術(shù)植株，研究其對(duì)茅蒼術(shù)藥材產(chǎn)量和道地性形成的影響提供了重要依據(jù)。

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