孫海峰，賈秀娟

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

紫花苜蓿(Medicago sativa L．)簡稱苜蓿，為1年生或多年生的草本植物，屬豆科草類，國內(nèi)外均有分布，是草原地帶栗鈣土和暗栗鈣土的典型植物［1］?！侗静菥V目》謂其能“安中利人，可久食。利五臟，輕身健體，洗去脾胃間邪熱之氣，通小腸諸惡熱毒”［2］。苜蓿黃酮類化合物是一種天然的抗氧化劑，具有多種生物活性。在抗衰老、抗菌、抗病毒、抗癌、抗腫瘤、護(hù)肝、抑制高血壓、高血脂、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、預(yù)防心血管疾病及止痛鎮(zhèn)痛等方面都具有良好的作用［4－6］。隨著人們醫(yī)療保健意識的增強(qiáng)，具有多功能的苜蓿黃酮有廣闊應(yīng)用前景，但目前苜蓿黃酮提取工藝落后，因此，本研究采用均勻設(shè)計(jì)法安排實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化苜?？傸S酮提取富集工藝，為苜蓿黃酮開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

1．1 儀器

SP－722E型可見分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司);FA1004N型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司);恒溫水浴箱(江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠);植物微型粉碎機(jī)(天津泰斯特儀器有限公司);K－Q500E型醫(yī)用超聲清洗儀器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1．2 試劑

蘆丁對照品(成都思科華生物技術(shù)有限公司，純度98%);亞硝酸鈉(分析純，天津市化學(xué)試劑六廠三分廠);硝酸鋁(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);氫氧化鈉(分析純，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司);95%乙醇(分析純，北京化工廠);AB－8，HPD－600，D101 大孔樹脂(南開大學(xué)化工廠)。

2 方法與結(jié)果

2．1 黃酮的含量測定

2．1．1 最大吸收波長的確定

對照品溶液與供試品溶液在200～700nm處進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)在265nm或357nm附近有最大吸收峰，且357nm最穩(wěn)定可靠，因此實(shí)驗(yàn)中選擇該波長。

2．1．2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

取蘆丁對照品溶液 0、1、2、3、4、5ml，分別置 10ml容量瓶中，加 5%亞硝酸鈉溶液 0．3ml，搖勻，放置6min，加 10%硝酸鋁溶液 0．3ml，搖勻，放置 6min，加1mol/l氫氧化鈉4．0ml，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，放置15min后于選定的測定波長處測吸光度，以濃度C為縱坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得方程。標(biāo)準(zhǔn)曲線 Y=12．997X－0．0054，R=0．9997。

2．1．3 供試品溶液的制備

取苜蓿10g，精密稱量，置圓底燒瓶中，加入乙醇120ml，回流提取1h，共2次，過濾，冷卻后取部分溶液離心5min，取藥液0.5ml置10mL容量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度。

2．1．4 精密度實(shí)驗(yàn)

取蘆丁對照品溶液(0．1mg/ml)適量，連續(xù)測定6次，RSD為=0．47%，表明精密度良好。

2．1．5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取供試品溶液，分別于 0、10、30、60、90、120min 測定，RSD為1．00%，表明穩(wěn)定性良好。

2．1．6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

分別取同一批次的苜蓿提取物，平行取樣6份，制成供試品溶液，依法測定，RSD為1．04%，表明重現(xiàn)性好。

2．1．7 加樣回收實(shí)驗(yàn)

精密稱取已知含量的藥材粉末6份，每份約50mg分別加入一定的蘆丁對照品溶液，按供試品溶液制備項(xiàng)下操作制備樣品溶液，與510nm處測定吸收率，計(jì)算回收率為98．91%，RSD為1．74%。

2．2 提取方法的考察

稱取10g苜蓿粉末3份，加入120ml 70%的乙醇，分別用加熱回流萃取、冷浸提取、超聲萃取的方法提取2次，每次1h，冷卻后取部分溶液離心5min，再取0.5ml稀釋到10ml測吸光度，回流提取制備液吸光度值最大，結(jié)果表明，回流提取方法最好。

2．3 提取工藝的優(yōu)化

采用均勻設(shè)計(jì)法，按U6(63)選用固液比(A)，乙醇濃度(B)，提取時(shí)間(C)三個(gè)因素，每個(gè)因素6個(gè)水平，共進(jìn)行6個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次，每份10g。從節(jié)省原料的角度考慮選擇70%的乙醇。見表1、表2。

表1 提取因素水平表

表2 均勻?qū)嶒?yàn)結(jié)果 (n=3)

經(jīng)多元回歸分析得回歸方程:Y=37．0523－0.9449X1+0．0030X2×X2－0．0072X1×X2+0．0592X1×X3。

經(jīng)檢驗(yàn)，復(fù)相關(guān)系數(shù) R=0．9998;F=4000．9，F(xiàn)＞F0．1(4．1)，表明方程顯著，黃酮提取率和各因素間有很好的線性關(guān)系。對方程進(jìn)行優(yōu)化求極大值，在檢驗(yàn)精度 α=0．05 條件下，得出優(yōu)化參數(shù) X1=71．0、X2=128．1、X3=19。即醇濃度 71%料液質(zhì)量比為1∶19，提取時(shí)間128min，此時(shí)提取率預(yù)測值為34．2mg/g。經(jīng)實(shí)驗(yàn)測定能達(dá)到這個(gè)預(yù)測值，表明所優(yōu)化的條件為最優(yōu)水平。

2．4 大孔吸附樹脂富集工藝條件優(yōu)化

2．4．1 上樣方法考察

分別采用干法和濕法上樣，樹脂選用D101，干法上樣取大孔樹脂20g，精密稱70%乙醇提取物1．0g，拌入10g樹脂中，揮干溶劑，干法加樣于裝好的樹脂柱中，依次用6BV蒸餾水，10BV 95%乙醇洗脫，控制流速為1ml/min，收集水和乙醇洗脫液，回收溶劑至干。濕法上樣取預(yù)處理好的D101 大孔樹脂30g，裝柱待用。精密稱取醇提物1g，用10mL蒸餾水超聲加熱溶解，加樣于裝好的樹脂柱中，飽和24h，其它條件同干法上樣。測定大孔樹脂D101對總黃酮的比吸附率和解吸率。結(jié)果見表3。

表3 上樣方法的考察

結(jié)果表明干法上樣優(yōu)于濕法上樣。

2．4．2 樹脂型號考察

取處理好的 AB－8(弱極性)，D101(非極性)，HPD(極性)三種型號大孔樹脂各20g，采用2．4．1 干法上樣法，測定總黃酮含量，計(jì)算樹脂的比吸附率和解吸率。結(jié)果見表4。

表4 樹脂型號考察結(jié)果

結(jié)果表明，D101 樹脂比吸附率(18．6mg/g)和解吸率(74．6%)較高，因而選擇D101 樹脂。

2．4．3 最佳拌樣比

將預(yù)處理好的大孔樹脂各15g裝于四根徑高比一致的柱子中待用，按樹脂(g):生藥量(g)為1∶0．4，1∶0．7，1∶1，1∶1．5 的比例依次稱取 4 份，采用 2．4．1干法上樣法，測定各組有效成分的含量。結(jié)果見表5。

表5 最佳拌樣比結(jié)果

結(jié)果表明，最佳拌樣比1∶1 時(shí)總黃酮泄漏量較小，效果好。

2．4．4 上樣量考察

取預(yù)處理好的樹脂10g，15g，20g，25g分別裝于四根徑高比一致的柱子中，采用2．4．1 干法上樣法，測定總黃酮泄漏量和總黃酮泄漏百分率。結(jié)果見表6。

表6 上樣量考察結(jié)果

上樣量考察結(jié)果表明，1∶20 時(shí)總黃酮泄漏量小，效果較佳。

2．4．5 水洗脫體積考察

取預(yù)處理好的D101 大孔樹脂20g裝柱待用，采用2．4．1 干法上樣法，用蒸餾水洗脫，每BV(30ml)為一個(gè)考察單位，控制流速為1ml/min，各自收集洗脫液，檢測有效成分泄漏量。結(jié)果見表7。

表7 水洗脫體積考察

結(jié)果表明，在節(jié)約資源的前提下，2倍水洗脫體積泄漏量較低，總黃酮含量最高，因此，選擇2倍水體積。

2．4．6 乙醇洗脫濃度的考察

精密稱取提取物1．0g，采用2．4．1 干法上樣法，分別用30%，50%70%，95%的乙醇洗脫，測定所得干膏中黃酮含量，有效成分解析率。結(jié)果見表8。

表8 乙醇洗脫濃度考察結(jié)果

結(jié)果表明，70%乙醇洗脫總黃酮含量、解析率最高，因此，70%乙醇洗脫效果最佳。

2．4．7 乙醇洗脫體積的考察

取處理好的大孔吸附樹脂，采用2．4．1 干法上樣法，用70%乙醇洗脫，每1BV為一個(gè)考察單位，收集4份，回收溶劑至干，稱重，測定干膏中總黃酮的含量和總黃酮累計(jì)轉(zhuǎn)移率。結(jié)果見表9。

表9 乙醇洗脫體積考查

結(jié)果表明，本著節(jié)約原則3倍乙醇洗脫總黃酮含量累積較高，轉(zhuǎn)移率68．6%，因此，3倍乙醇洗脫體積最優(yōu)。

2．4．8 洗脫流速考察

取處理好的大孔吸附樹脂20g 4份，分別裝于相同規(guī)格的四根柱中，采用2．4．1 干法上樣法，分別用3BV 的水洗脫，然后分別以 1、2、3、4 ml/min流速，用70%乙醇洗脫，測定得到干膏中總黃酮的含量，計(jì)算總黃酮轉(zhuǎn)移率，分別為 82．4%、84．6%、79．7%、71.0%。結(jié)果表明，總黃酮轉(zhuǎn)移率在流速控制在2ml/min，由洗脫流速和樹脂柱截面積的關(guān)系得出，洗脫流速為0.325ml/cm2/min總黃酮轉(zhuǎn)移率最高。

3 討論

目前，對苜蓿黃酮的提取有冷浸提取、微波提取和超聲提取法，但提取率不高。如張?jiān)伱罚?］的微波提取苜蓿黃酮的最佳工藝為:40%乙醇濃度，1∶30 固液比，微波500w功率下作用60s;在此工藝條件下，黃酮提取量的理論值為 4．92mg/g，接近于實(shí)際測定值4.88mg/g。朱宇［7］的苜蓿黃酮最佳提取條件為乙醇濃度60%，料液比1∶35，提取溫度50℃，提取時(shí)間1.5h，在此最佳條件下苜蓿異黃酮的提取率為17.12mg/g。本實(shí)驗(yàn)的提取率高于前人的結(jié)果，提取率預(yù)測值為34．21mg/g。進(jìn)一步對大孔樹脂富集工藝進(jìn)行優(yōu)化，對于紫花苜?？傸S酮以D101 樹脂效果較好，得最佳富集工藝為，拌樣比1∶1，上樣量1∶20，2倍水體積洗脫洗滌，70%醇洗脫，3倍乙醇洗脫體積，流速控制在2ml/min。在此條件下得到的紫花苜?？傸S酮收率為4.9%，富集物總黃酮含量為51%，有效成分轉(zhuǎn)移率86．5%，對紫花苜?？傸S酮的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

正交設(shè)計(jì)法在黃酮類化合物在提取純化優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)研究中采用的較多，該種方法相對完全實(shí)驗(yàn)減少了實(shí)驗(yàn)次數(shù)，使實(shí)驗(yàn)條件得到優(yōu)化，但是該方法的優(yōu)化結(jié)果是從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)有限的因素水平中得到的結(jié)果，由于水平少，不能得到最佳水平。然而均勻設(shè)計(jì)法彌補(bǔ)了這一不足，通過增加水平數(shù)，建立線性回歸方程求極值，計(jì)算出最佳水平，本實(shí)驗(yàn)在均勻設(shè)計(jì)的條件下得到的數(shù)據(jù)結(jié)果科學(xué)合理。

［1］ 王勇，劉學(xué)義．我國苜蓿研究現(xiàn)狀、存在問題及對策［J］．內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技，2004(6):6－7．

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［3］ 胡明，盧德勛，牛文藝，等．苜蓿皂甙及其生物活性［J］．中國畜牧獸醫(yī)，2007，34(1):9－12．

［4］ 何春年，李展，高微微，等．紫花苜?；瘜W(xué)成分的研究［J］．天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2008，20(6):1005－1011．

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［6］ 張?jiān)伱罚淌?，曹致中，等．微波輔助提取苜蓿黃酮方法的研究［J］．草地學(xué)報(bào)，2008，16(1):76－80．

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