梁群，趙慧芳，朱永志

(黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

腦出血，屬于中醫(yī)學中出血性中風，是一種常見病、多發(fā)病，已經(jīng)證實其患病率、致殘率及病死率均有所上升。目前，現(xiàn)代醫(yī)學對腦出血主要是對癥、支持治療，如脫水降顱壓，防治腦組織細胞水腫等，其預后效果并不理想。本研究主要是通過觀察中風1號湯劑對急性腦出血大鼠的神經(jīng)缺損功能以及改善腦水腫癥狀的作用，并測定在中藥干預后，NSE及S100 mRNA濃度的變化，探討中風1號治療急性腦出血的療效，為中西醫(yī)結合治療急性腦出血提供一定的參考。

1 材料與方法

1．1 實驗動物

Wistar大鼠30只，體質(zhì)量(200±15)g，均為雄性，黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，清潔級標準飼養(yǎng)。

1．2 主要儀器及試劑

50ul及100ul微量進樣器、大鼠灌胃器(上海佳安儀器廠);大鼠腦立體定向儀(北京博大泰克公司);電子天平(上海精密科學儀器有限公司);手持式牙科鉆(上海齒科醫(yī)械廠);大鼠斷頭器、大鼠腦切片模具(湖北省黃石市醫(yī)療器械廠);Olympus DX40 光學顯微鏡(日本Olympus公司);光學顯微照相系統(tǒng)(日本Olympus公司);電熱恒溫箱(WMK－02型);DY－1型水平電泳儀、ZF－1型紫外線透射反射分析儀(重慶四達實驗儀器有限公司);GIS數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)(北京聯(lián)想有限公司);即用型SABC免疫組化染色試劑盒(上?；萜展?;NSE兔抗鼠單克隆抗體、S100 兔抗鼠單克隆抗體和POLY－L－LYSINE(多聚賴氨酸)(北京中杉公司);DAB顯色試劑盒、PBS緩沖液和磷酸緩沖液和總RNA快速提取試劑盒(上海惠普公司)。

中風1號主要是由黃芪、川芎、當歸等中藥配伍而成(黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院院內(nèi)制劑);肝素鈉注射液(12500U/2ml，2ml×10 支);20%甘露醇(250ml/瓶);注射用青霉素鈉(160 萬u/瓶);瓊脂糖(上海生工生物工程技術有限公司)。

2 實驗方法

2．1 動物分組

將30只雄性大鼠隨機分為3組，每組10只，分別為模型組，對照組，實驗組(即中風1號加用甘露醇組)。測定大鼠腦組織NSE及S100 mRNA的變化。

2．2 造模

大鼠急性腦出血模型:根據(jù)參考文獻［1－7］制備大鼠腦出血模型，出血量經(jīng)過計算，約等同于人腦出血量10ml，20ml，30ml，40ml。

2．3 給藥

對照組:生理鹽水，1．5ml/次，灌胃 1次/日，腹腔注射1次/日。模型組:生理鹽水加甘露醇，1．5ml/次，灌胃1次/日，腹腔注射1次/日。實驗組:中風1號湯劑加甘露醇，1．5ml/次，灌胃1次/日，腹腔注射1次/日。以上動物在造模術后，分別持續(xù)給藥3天。HE染色觀察大鼠腦組織出血后，血腫周圍組織形態(tài)。

用免疫組化法，測定大鼠腦組織中NSE、S100的表達。

2．4 石蠟切片微波修復抗原染色程序 1)烤干切片;2)熱修復抗原;3)自然冷卻后PBS(pH=7．0)洗滌3次，每次5min;4)在25℃ ～27℃下滅活內(nèi)源性酶;5)滅菌蒸餾水洗滌，PBS水洗，3次，每次5min;6)加5%BSA的封閉液，室溫下1h;7)5℃下，去掉余液體，加一抗;8)滴加生物素化鼠抗兔IgG;9)滴加試劑SABC;10)PBS重復洗3次;11)DAB顯色;12)于鏡下觀察，復染，分化，返藍;13)脫水并封片處理。

TA克隆后通過PCR鑒定陽性克隆送測序，測序結果結果經(jīng)過BLAST比對除去載體序列及與原MLAA-22重疊的部分后，在5'端延伸了424 bp。

2．5 圖像的分析及處理 光鏡下可見，陽性著色為神經(jīng)細胞的胞漿被染成黃色、棕黃色或棕褐色。顯微鏡采集視野圖片，用圖像分析儀觀察每張切片，同時測定腦組織中NSE和S100的值，每張切片均取5～6個視野，取其平均值。

2．6 大鼠腦組織中 NSE及 S100 mRNA的水平的測定

2．6．1 提取腦組織中總RNA1)取大鼠的腦組織(約250mg)，將腦組織研磨成粉狀(要在液氮中進行)，將粉末快速轉移到 5．0ml的離心管內(nèi)，再加2.0ml Trizol，劇烈搖動離心管。2)加200ml的氯仿/異戊醇(20∶1)，搖晃約 1 min使其混合均勻。3)15000rpm離心3min。4)將大約500ul的上清液轉移到2．0ml離心管中，加入100ul無水乙醇，混勻。5)將溶液全部轉移到2ml收集管內(nèi)(在GenClean柱中)，5min后離心。6)取出柱子后扔掉廢液，再將柱子放回管中，400ul RPE－Solution 13000rpm離心30s;于術后第3天，采集血清，測腦組織NSE及S100的濃度，稱重后戊巴比妥鈉麻醉，大鼠腦組織以針道為中心，前后各取腦片3mm，一片置于福爾馬林中固定，另一片置于液氮中冷凍。7)步驟6 重復1次。8)先將柱子取出來，收集管放回后離心，再次把柱子放進離心管中。9)給內(nèi)膜中間加進去 40ul的 DEPC－H2O，90℃，15000rpm下離心3min，可得到RNA樣品，即管內(nèi)的溶液。10)測OD值 (取260/280)，比值大于2．0的(包括2．0)，算出得到的RNA總的含量，取其中的10μg做逆轉錄。11)調(diào)節(jié)RNA濃度至10μg/μl。

RNA總的濃度=A260×50/2000×稀釋的倍數(shù)

2．6．2 RT(逆轉錄)反應

逆轉錄總的反應體積約20μl，每組均設有3個復管。在Eppendorf管中加3μl OligdT和2ul RNA，變性(75℃)，在置入冰中后，依次加入:dNTP 2μl，DEPC 水10ul，5 × Buffer 5μl、Rnasin 2．0μl、AMV 0．5ul。50℃反應1．5h，將產(chǎn)物保存于零下20℃冰箱內(nèi)。

2．6．3 PCR(聚合酶鏈反應)

1)合成引物:據(jù)國際cDNA文庫檢索的原始序列，參照文獻設計受體引物序列。2)聚合酶鏈的反應:總的反應體積為30μl，每組有3個復管。在PCR管中依次加:Buffer 5μl、dNTP 5μl、上游引物 1．5μl、下游引物1．5μl、cDNA 1．5μl、Taq 酶 2．0μl、無菌蒸餾水 20μl，加完后，把各個復管內(nèi)的液體混勻。放入PCR儀，80℃下變性，10min。3)凝膠電泳瓊脂糖:瓊脂糖2.0g，加到50ml的TAE中，加熱后搖勻，冷卻至60℃，灌膠。泳道的上樣量約為10μl的PCR產(chǎn)物，給其加5μl緩沖液，再電泳2．0h。觀察電泳結果，運用凝膠成像系統(tǒng)，算出NSE和S100 及GAPDH的比值(產(chǎn)物條帶面積×強度)。

2．7 統(tǒng)計學處理

運用SPSS 17．0 醫(yī)學統(tǒng)計軟件分析，實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(±s)表示，以P＜0．05 為有差異具有統(tǒng)計學意義，組間數(shù)據(jù)的比較用方差分析。

3 實驗結果

3．1 各組大鼠腦組織形態(tài)的觀察結果

正常NSE分布于神經(jīng)元細胞的胞漿和突起中［6］，神經(jīng)細胞結構整齊，形態(tài)正常，NSE陽性細胞呈棕黃色。造模成功后可觀察到:細胞核呈深染的藍色，神經(jīng)元細胞的胞漿內(nèi)廣泛分布著深染的棕黃色，呈顆粒樣的物質(zhì)，尤其在出血區(qū)周圍的細胞內(nèi)，顏色深，而且著色面積也較大。模型組與對照組比較，均存在顯著性差異(P＜0．05)，即在腦出血后，大鼠神經(jīng)元細胞胞漿和突起中的NSE就會從細胞內(nèi)釋出;實驗組與模型組相比，有顯著性差異(P＜0.05)，即用中風1號湯劑可以有效地減少NSE的釋出。

正常S100 蛋白陽性的細胞為神經(jīng)膠質(zhì)細胞，細胞膜完整，陽性物質(zhì)均勻分布于胞核、胞漿和突起中，呈棕黃色［7］。實驗觀測到，造模成功的大鼠腦組織血腫周圍的免疫反應增強，陽性細胞的數(shù)量也有一定的增加，同時在細胞間質(zhì)中，也可見到陽性物質(zhì)，顏色不均勻，說明存在腦細胞的破壞，尤其是出血量為51ul、65ul水平的則更為明顯。模型組與對照組比較，有顯著性差異(P＜0．05);實驗組與模型組相比，具有顯著性差異(P＜0．05)，即藥物治療對于腦出血有明顯的改善作用。

3．2 各實驗組大鼠腦組織中NSE和S100 mRNA的含量測定

凝膠電泳大鼠腦組織S100 和GAPDH的擴增產(chǎn)物，條帶分別為272bp和490bp，掃描后半定量分析S100/GAPDH的吸光比值，研究得出:在急性腦出血后，造模大鼠的各個出血量水平S100 mRNA的表達和對照組相比，均具有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)，即腦出血后S100 mRNA的表達增高，尤其是51ul、65ul水平S100 mRNA的表達升高最顯著，說明S100 mRNA也是監(jiān)測腦組織損傷特異、靈敏的指標;實驗組與模型組比較，有顯著性差異(P＜0．05)，即使用中西醫(yī)藥物聯(lián)合對于治療腦出血有明顯的改善作用。見表1～3。

表1 各組大鼠腦組織出血灶周圍NSE的表達(±s，n=10)

表1 各組大鼠腦組織出血灶周圍NSE的表達(±s，n=10)

注:與對照組比較，*P ＜0．05，＊＊P＜0．05;與模型組比較，△P ＜0.05。

對照組0．09 ±0．02 0．08 ±0．03 0．11 ±0．05 0．07 ±0．04模型組 151．15 ±7．53* 155．58 ±8．88* 160．24 ±6．92* 167．31 ±7．61*實驗組 139．12 ±8．53＊＊△ 146．45±7．05＊＊△ 151．09±8．97＊＊△ 155．15 ±6．93＊＊△

表2 各組大鼠腦組織出血灶周圍S100 表達(±s，n=10)

表2 各組大鼠腦組織出血灶周圍S100 表達(±s，n=10)

注:與對照組比較，*P ＜0．05，＊＊P＜0．05;與模型組比較，△P ＜0．05。

對照組0．08 ±0．03 0．06 ±0．02 0．13 ±0．10 0．07 ±0．03模型組 149．77 ±15．86* 155．22 ±16．53* 162．36 ±12．57* 170．76 ±14．81*實驗組 129．94 ±13．97＊＊△ 136．53 ±14．81＊＊△ 149．32 ±13．897 152．18 ±15．23＊＊△

表3 各組大鼠腦組織S100 表達(±s，n=10)

表3 各組大鼠腦組織S100 表達(±s，n=10)

注:與對照組相比，*P ＜0．05，＊＊P＜0．05;與模型組比較，△P ＜0．05。

對照組0．03 ±0．01 0．04 ±0．02 0．07 ±0．03 0．05 ±0．02模型組 24．17 ±2．53* 25．08 ±3．27* 30．65 ±2．31* 32．22 ±3．27*實驗組 18．53 ±4．38＊＊△ 20．69±3．51＊＊△ 23．57±5．07＊＊△ 27．09 ±3．73＊＊△

本實驗退火溫度從50℃ ～60℃，多次重復PCR循環(huán)過程，在各組的38ul、51ul水平上出現(xiàn)了相對清楚的目的基因條帶，25ul和38ul也出現(xiàn)了目的基因條帶，相對較彌散，初步考慮可能是因為S100 mRNA在腦組織中表達相對弱。

4 討論

中風1號是由黃芪，川芎和當歸等中藥配伍而成，從中醫(yī)理論立法處方，具有祛瘀通絡，益氣活血，扶正固本的功效，可緩解急性期腦出血和改善神經(jīng)功能缺損的癥狀，有效改善患者預后，提高患者的生存質(zhì)量，是治療急性腦出血臨床驗方。

實驗中使用中風1號干預后，明顯調(diào)節(jié)了NSE和S100 mRNA在腦組織中的表達，隨著出血量的增加其表達也逐漸增加，且NSE的變化比S100 更能直接的反映腦組織的損傷程度，同時從實驗中也證明了中風1號可明顯調(diào)控 NSE、S100的水平，保護損傷的腦組織。

從本實驗研究的結果可以看出，實驗大鼠的腦出血性損傷引起的神經(jīng)功能缺損及腦水腫，實驗組可有效的改善愈后，在降低NSE和S100 mRNA的方面，明顯優(yōu)于模型組。其作用機制還有待進一步的研究。目前我們推測其可能是因為中風1號有效的改善了腦部的血流動力學，使神經(jīng)元細胞的細胞膜相對穩(wěn)定，維持BBB正常的通透性，同時也減少組織液的滲出，減輕腦水腫，從而降低了NSE和S100 mRNA的釋放，具有保護腦神經(jīng)組織，改善患者預后的作用。本實驗中的中西藥物聯(lián)合治療急性腦出血，吸取了中西藥各自的優(yōu)點，證實了臨床使用中風1號治療急性腦出血是安全有效，為臨床開展中西醫(yī)結合治療急性腦出血提供了一定的參考。

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