張 悅，周 毅，張 怡，劉 巍

(1.河北醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，2.河北省腎臟病重點實驗室，河北 石家莊 050017;3.河北醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院內(nèi)科，河北石家莊 050000;4.河北省保定市傳染病醫(yī)院，河北保定 070000)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一。研究顯示，足細(xì)胞損傷在糖尿病腎病的進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用［1－2］。Nestin是屬于第Ⅵ類中間絲的細(xì)胞骨架蛋白，對維持足細(xì)胞的形態(tài)和功能起著重要作用［3－4］。我們前期研究［5－6］表明，高糖刺激的足細(xì)胞中，nestin表達(dá)降低，與足細(xì)胞損傷關(guān)系密切;細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase 5，Cdk5)參與了對足細(xì)胞nestin表達(dá)的調(diào)節(jié)。本實驗擬通過腹腔注射Cdk5抑制劑Roscovitine，從體內(nèi)進(jìn)一步觀察Cdk5對腎功能及nestin表達(dá)的影響，以明確Cdk5的作用機(jī)制，為糖尿病腎病的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 Wistar♂大鼠由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。Roscovitine和鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)購自Sigma公司。鼠Nestin單克隆抗體購自Abcam公司，兔抗pnestin抗體購自Santa Cruz公司。二步法抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒購自Gene Tech公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠/兔IgG購自北京中杉金橋公司。ECL發(fā)光試劑盒購自Thermo Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病大鼠模型制備及分組 Wistar大鼠25只，隨機(jī)分為兩組:正常對照組(Control組，n=5)、糖尿病組(DM組，n=20)。DM組大鼠一次性腹腔注射 STZ 65 mg·kg－1［7］，48 h 后測血糖≥16.7 mmol·L－1且尿糖陽性者為造模成功。DM組大鼠隨機(jī)分為4組(n=5):DM組;DMSO處理組(DM+D組);Roscovitine低劑量處理組(DM+R-L組);Roscovitine高劑量處理組(DM+R-H組)。DM+D組每日腹腔注射400 μl DMSO;DM+R-L組和DM+R-H組每日分別按2.8和5.6 mg·kg－1腹腔注射 Roscovitine(溶于400 μl DMSO 中)。

1.2.2 標(biāo)本留取 成模后第16周末處死大鼠。處死前1 d稱重，收集24 h尿液，記錄尿量。股動脈取血用于生化指標(biāo)檢測;麻醉后開腹取雙側(cè)腎臟，稱重。左側(cè)腎臟用于透射電鏡和組織病理檢測;右側(cè)腎臟取皮質(zhì)－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 生化指標(biāo)測定 日立7170-A全自動生化分析儀檢測血糖(Glu)、尿素氮(BUN)、24 h尿蛋白(Alb)。以腎重(Kidney weight，KW，mg)與體重(Body weight，BW，g)比值作為腎臟指數(shù)(Kidney Index，KI)。

1.2.4 常規(guī)病理學(xué)觀察 腎組織石蠟包埋，PAS染色，光鏡下觀察腎組織形態(tài)學(xué)改變。

1.2.5 免疫組化檢測nestin在腎小球的表達(dá) 采用二步法免疫組化試劑盒，操作步驟參照說明書。每張切片選取10－15個腎小球，經(jīng)Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行半定量分析，得出每個腎小球的積分光密度值(IOD)，取其平均值為該標(biāo)本的nestin陽性表達(dá)值。

1.2.6 腎小球的分離與提取 剪碎腎皮質(zhì)，分別經(jīng)80目、

140 目和200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾，收集篩網(wǎng)上的物質(zhì)，離心

后所得沉淀物為腎小球。

1.2.7 Western blot檢測腎小球中 nestin和p-nestin的表達(dá)提取腎小球總蛋白，考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測蛋白表達(dá)。以β-actin作為內(nèi)參。各條帶信號強(qiáng)度應(yīng)用LabWork45圖像分析軟件進(jìn)行定量分析，測定其吸光度值(IOD)。

Tab 1Physical and metabolic parameters among different groups(±s)

Tab 1Physical and metabolic parameters among different groups(±s)

*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs DM group;△P＜0.05 vs DM+D group.

Group BW/g KW/mg KI/mg·g－1 Glu/mmol·L －1 BUN/mmol·L －1Alb/mg Control 416 ±34 1037 ±82 2.49 ±0.19 7.81 ±1.24 6.74 ±1.25 1.28 ±0.14 DM 263 ±34* 1348 ±69* 5.17 ±0.54* 33.39 ±1.71* 21.08 ±2.46* 9.69 ±1.77*DM+D 269 ±28* 1299 ±64* 4.83 ±0.74* 34.11 ±1.49* 20.36 ±2.68* 8.79 ±2.25*DM+R-L 256 ±37* 1356 ±101* 5.30 ±0.29* 31.20 ±2.57* 17.12 ±3.01*#△ 5.96 ±2.13*#△DM+R-H 262 ±30* 1296 ±85* 5.08 ±0.21* 32.01 ±1.82* 17.61 ±2.49*#△ 5.49 ±2.28*#△

2 結(jié)果

2.1 一般情況 DM組體重明顯降低，KI、Glu、BUN和Alb明顯升高(P＜0.05)。Roscovitine處理后，與 DM組相比，BUN和Alb明顯降低(P＜0.05)，KI和Glu無明顯變化，低劑量和高劑量兩組間各指標(biāo)無明顯差異(Tab 1)。

2.2 腎組織形態(tài)學(xué)觀察 PAS染色，DM組出現(xiàn)明顯的腎小球肥大、系膜區(qū)增寬，系膜細(xì)胞增生和基質(zhì)增多。電鏡顯示，DM大鼠腎小球基底膜不規(guī)則增厚，足細(xì)胞大量足突融合增寬。Roscovitine處理后，上述病變明顯減輕。

2.3 腎小球中nestin和p-nestin蛋白的表達(dá) 免疫組化和Western blot結(jié)果均顯示，DM組大鼠腎小球中nestin表達(dá)降低，p-nestin表達(dá)增高;Roscovitine可逆轉(zhuǎn)上述結(jié)果。低劑量和高劑量兩組間相比無明顯差異(Tab 2)。

Tab 2 Effects of Roscovitine on nestin and p-nestin protein expression in kidney of different group rats(±s)

Tab 2 Effects of Roscovitine on nestin and p-nestin protein expression in kidney of different group rats(±s)

*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs DM group;△P＜0.05 vs DM+D group.IHC:Immunohistochemisty;WB:Western blot.

Group Nestin/IHC，IOD Nestin/WB，IOD p-nestin/WB，IOD Control 141.49 ±15.77 1.07±0.09 0.25 ±0.01 DM 59.48 ±6.18* 0.17±0.03* 0.88 ±0.04*DM+D 61.38 ±6.79* 0.21±0.03* 0.82 ±0.07*DM+R-L 92.39 ±12.27*#△ 0.64±0.07*#△ 0.51 ±0.03*#△DM+R-H 88.24 ±17.56*#△ 0.69±0.17*#△ 0.52 ±0.09*#△

3 討論

Cdk5是細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶(CDK)家族成員，與其亞基p35結(jié)合而被激活，通過磷酸化底物而發(fā)揮其生物學(xué)作用。Roscovitine可通過選擇性替代CDK與ATP結(jié)合部位上的腺嘌呤，由于其與Cdk5的親和性較高，而被作為Cdk5/p35的高效特異性抑制劑。本實驗我們采用體內(nèi)注射Roscovitine干預(yù)糖尿病大鼠，發(fā)現(xiàn)BUN和尿白蛋白水平明顯降低;腎小球系膜區(qū)增生、基質(zhì)沉積和基底膜病變明顯減輕;足細(xì)胞足突融合減輕。提示Roscovitine可在一定程度上減輕糖尿病大鼠腎臟病變及腎功能損傷。

作為一種重要的細(xì)胞骨架蛋白，nestin對維持細(xì)胞正常形態(tài)和功能具有重要作用。Cdk5與nestin在腎小球中有共定位表達(dá)，二者關(guān)系密切［8］。本研究中，Roscovitine可升高nestin表達(dá)水平，降低p-nestin的表達(dá)。因此我們推測Roscovitine減輕糖尿病大鼠腎功能的損傷，其機(jī)制可能與抑制Cdk5后，減少nestin磷酸化并增強(qiáng)其生物學(xué)功能有關(guān)。對Roscovitine的深入研究，將為糖尿病腎病的防治開拓一條新的思路。

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