何仁勝 方春華 常 城 劉少平

（湖北省黃石市中心醫(yī)院，湖北 黃石 435000）

本實(shí)驗(yàn)過以高脂飼料喂養(yǎng)的方法制造單純性肥胖大鼠模型，并采取穴位電針刺激方法，觀察電針刺激對(duì)大鼠攝食量、體質(zhì)量的影響，并檢測(cè)血液中瘦素（Leptin）、神經(jīng)肽Y（NPY）等攝食和能量代謝相關(guān)激素的變化。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康剛斷乳的SD雄性大鼠38只，體質(zhì)量65～80 g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 試劑與儀器 Leptin放免試劑盒，購(gòu)于北京科美東雅生物技術(shù)有限公司。NPY放免試劑盒，購(gòu)于北京科美東雅生物技術(shù)有限公司。G805電針治療儀，福建醫(yī)療器械廠生產(chǎn)。

1.3 分組與造模 隨機(jī)分為兩組，對(duì)照組8只，普通飼料喂養(yǎng)，高脂組30只，高脂飼料喂養(yǎng) （普通飼料60%、豬油 12%、蔗糖 5%、奶粉 5%、花生 5%、雞蛋10%、麻油1%、食鹽2%）［1］。動(dòng)物居住環(huán)境溫度控制在25～30℃，濕度適宜，通風(fēng)良好，明暗周期12 h，所有大鼠在造模期間自由攝食和飲水，每日晨暮各更換1次食水。每日記錄攝食量、飲水量，每周定時(shí)測(cè)量體質(zhì)量。14周后，若高脂組大鼠體質(zhì)量超過空白組大鼠平均體質(zhì)量的20%，且其體質(zhì)量連續(xù)2周內(nèi)周增幅＞10 g認(rèn)為單純性肥胖大鼠模型造模成功。有15只大鼠造模成功。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為兩組，模型組7只，針刺組8只。

1.4 針刺方法 針刺時(shí)間固定在每日下午3∶00～5∶00，由專人操作。將實(shí)驗(yàn)組大鼠放入自制的固定器中固定，用75%酒精消毒后，用36號(hào)美容針直刺雙側(cè)后三里5 mm，直刺雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴1 mm，接通G805電針治療儀，采用頻率為15 Hz，強(qiáng)度為1.5 V的連續(xù)波，每穴刺激時(shí)間為15 min，每日1次，連續(xù)治療4周。模型組和對(duì)照組大鼠采取同樣的方式每日固定15 min。在為期4周的針刺過程中，控制環(huán)境溫度在25～30℃，模型組和針刺組大鼠繼續(xù)以高脂飼料喂養(yǎng)，對(duì)照組大鼠用普通飼料喂養(yǎng)，所有大鼠在造模期間自由攝食和飲水，每日晨暮各更換1次食水。每日記錄攝食量、飲水量，每周定時(shí)測(cè)量體質(zhì)量。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將大鼠禁食過夜，次日早晨斷頭處死，同時(shí)留取血樣。（1）Leptin測(cè)定：取全血 2 mL，37℃放置 30 min后，3000 r/min，4℃離心 5 min，分離血清，采用非平衡法，具體操作按說明書進(jìn)行，用放射免疫計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，由高年資專業(yè)放射免疫技師操作。（2）NPY測(cè)定：取全血3 mL，注入含10%EDTA Na230 μL和抑肽酶40 μL的試管中，4℃ 3000 r/min離心10 min，分離血漿。為排除蛋白質(zhì)的干擾，采取酸性乙醇提取法，具體步驟如下：取血漿0.5 μL加1 μL酸性無(wú)水乙醇（100 mL無(wú)水乙醇+冰醋酸1.2 mL），放震蕩器上震蕩1 min，4℃離心15 min，將上清倒入青霉素瓶?jī)?nèi)，在45℃水浴鍋上蒸干（24 h即可完全干燥）封口，－20℃保存。測(cè)定前每瓶加入pH7.4 PBS 0.5 μL溶解，混勻，倒入試管，－20℃ 4 h以上完全凍結(jié)，然后放置4℃溶解，取上清200 μL測(cè)定用，測(cè)定采用非平衡法，具體操作按說明書進(jìn)行，用放射免疫計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，由專業(yè)高年資放射免疫工作者操作。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 實(shí)驗(yàn)過程中，對(duì)照組和針刺組大鼠各死亡1只。對(duì)照組大鼠活潑好動(dòng)，皮毛清潔有光澤；肥胖組大鼠行動(dòng)遲緩，皮毛油膩污穢，對(duì)外界反應(yīng)遲鈍；針刺組大鼠反應(yīng)稍遲緩，皮毛色澤暗，但比模型組有光澤。

2.2 穴位電針刺激對(duì)大鼠體質(zhì)量和攝食的影響 在針刺開始前，針刺組和模型組大鼠的平均攝食量都為25 g/d，針刺1周后針刺組大鼠的平均攝食量為16 g/d，并持續(xù)此水平直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，但模型組大鼠的攝食量卻并沒有明顯變化（見圖1）。如表1所示，在為期4周的針刺過程中，對(duì)照組和肥胖組大鼠體質(zhì)量緩慢上漲，而針刺組大鼠體質(zhì)量在逐漸減少。針刺第1周后即可發(fā)現(xiàn)針刺組大鼠和肥胖組大鼠的體質(zhì)量有明顯的差異（P＜0.05）。

圖1 電針刺激對(duì)大鼠攝食量的影響

表1 各組大鼠針刺不同時(shí)期體質(zhì)量比較（g，）

表1 各組大鼠針刺不同時(shí)期體質(zhì)量比較（g，）

與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

2.3 穴位電針刺激對(duì)大鼠血中NPY和Leptin水平的影響 見表2。經(jīng)過四周的體表穴位電針刺激后，針刺組大鼠血中Leptin和NPY水平，明顯低于模型組；雖然針刺組NPY和Leptin水平依舊高于對(duì)照組大鼠，但是無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠血中NPY和Leptin水平比較（）

表2 各組大鼠血中NPY和Leptin水平比較（）

3 討 論

肥胖癥是一個(gè)以脂肪過多儲(chǔ)存為主要表現(xiàn)的慢性疾病常伴有代謝紊亂、代謝調(diào)節(jié)和神經(jīng)及內(nèi)分泌的異常。Leptin是一種主要由白色脂肪組織分泌的蛋白質(zhì)類激素，它是肥胖基因（OB基因）的編碼產(chǎn)物。其不但存在于胃主細(xì)胞和壁細(xì)胞，也存在胃底的內(nèi)分泌細(xì)胞中。故從某種意義上來(lái)說，Leptin也可以算一種胃腸肽類激素。Leptin由脂肪組織分泌后，進(jìn)入血液循環(huán)。其通過與下丘腦相關(guān)的反饋環(huán)實(shí)現(xiàn)抑制攝食作用。研究表明Leptin水平的高低與體內(nèi)脂肪組織蓄積成直接比例關(guān)系。NPY是1982年首次從豬腦中提取的一種含36個(gè)氨基酸的單鏈多肽，屬胰多肽家族。現(xiàn)在認(rèn)為NPY參與攝食的啟動(dòng)與維持，是下丘腦中最重要的食欲促進(jìn)因子，在下丘腦食欲調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中起著重要的作用。

本實(shí)驗(yàn)采取孫志等［1］推薦的高脂飼料配方，用剛斷乳的SD雄性大鼠（約1月齡）造模，由于這些大鼠未曾接受過普通飼料喂養(yǎng)，故對(duì)高脂飼料較為適應(yīng)。由于遺傳、個(gè)體差異等方面的影響，14周后，30只大鼠中只有15只制作單純性肥胖模型成功，造模成功率為50%。本實(shí)驗(yàn)觀察到，經(jīng)過1周持續(xù)規(guī)律的電針穴位電針刺激后，單純性肥胖大鼠的體質(zhì)量以及攝食量即可明顯下降，而持續(xù)四周的穴位電針刺激可以使單純性肥胖大鼠的體質(zhì)量持續(xù)下降，但攝食量卻無(wú)明顯變化。另外，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到單純性肥胖大鼠血清Leptin和NPY表達(dá)量比正常對(duì)照組明顯升高，并且體表后三里和內(nèi)關(guān)穴位電針刺后針刺治療后針刺組肥胖大鼠血Leptin和NPY表達(dá)下降。實(shí)驗(yàn)顯示針刺可以影響單純性肥胖大鼠體質(zhì)量和攝食量同時(shí)伴隨有血液中NPY和Leptin水平的改變，并且這種變化并不是由于應(yīng)激的影響［2］，提示電針刺激可能通過調(diào)整肥胖大鼠能量代謝的重要信號(hào)分子之一NPY水平，發(fā)揮減輕體質(zhì)量和抑制食欲作用，而肥胖大鼠體質(zhì)量下降的同時(shí)，可能是因?yàn)榉答佌{(diào)節(jié)，Leptin水平隨之下降。

［1］孫志，張中成，劉志誠(chéng).營(yíng)養(yǎng)性肥胖動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2002，18（4）：466-467.

［2］Zhang Y，Proenca R，Maffei M，et al.Positional cloning of the mouse obese gene and it shumanhomologue［J］.Nature.1994，372：425.