周海娟 顧 磊 張 玉

(1江蘇省揚(yáng)州市第三人民醫(yī)院內(nèi)科 揚(yáng)州 225000;2復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院老年科 上海 200040)

氯吡格雷為二磷酸腺苷受體拮抗劑，具有較好的抗血小板作用。2007年美國心臟病學(xué)會(ACC)/美國心臟學(xué)會(AHA)建議對使用阿司匹林胃腸道不能耐受的急性冠狀動脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)患者采用氯吡格雷替代治療［1］。隨著氯吡格雷在臨床上的廣泛應(yīng)用，其相關(guān)胃黏膜損傷甚至消化道出血的報(bào)道逐漸增多，2008年美國心臟病學(xué)會基金會(ACCF)/美國胃腸病學(xué)會(ACG)/AHA發(fā)布的聯(lián)合專家共識對氯吡格雷替代阿司匹林也提出了質(zhì)疑［2］。研究發(fā)現(xiàn)有潰瘍病史患者服用氯吡格雷一年中再出血率達(dá)12%，而且出血部位多為既往潰瘍部位［3］，但機(jī)制尚不明確，國內(nèi)外相關(guān)研究較少。本研究以乙酸性大鼠胃潰瘍模型為基礎(chǔ)，觀察氯吡格雷對胃潰瘍愈合的影響，以及對潰瘍底部微血管密度(microvessel density，MVD)、胃黏膜內(nèi)皮抑素(endostatin，ES)、血管內(nèi)皮生長因子A165(vascular endothelial growth factor A165，VEGF-A165)表達(dá)的影響，探討其延緩胃潰瘍愈合的機(jī)制。

材料和方法

材料 雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物部);氯吡格雷(杭州賽諾菲安萬特民生制藥有限公司);CD34單克隆抗體(上海長島生物技術(shù)有限公司);VEGF-A165 ELISA試劑盒及ES ELISA試劑盒(美國R＆D公司)。

方法

制模及標(biāo)本處理 將22只雄性SD大鼠運(yùn)用改良Okabe法［4］制作乙酸性胃潰瘍模型。潰瘍制作術(shù)后第3天，隨機(jī)處死6只大鼠(模型組)，解剖取胃，沿胃大彎剪開胃壁，冰生理鹽水沖洗干凈后平鋪，將潰瘍邊緣勾畫在玻璃紙上，以便用每小方格1 mm×1 mm的坐標(biāo)紙測量潰瘍面積。剩余大鼠隨機(jī)分為氯吡格雷組(10 mg/kg)和生理鹽水組，每組8只。各組分別胃內(nèi)灌注0．2%氯吡格雷或生理鹽水，1 mL/200 g體質(zhì)量，1次/天，共7天。末次給藥后禁食(不禁水)24 h，處死所有大鼠，參照上述方法測量潰瘍面積。取包括潰瘍底部和邊緣在內(nèi)的3 mm組織條，置于4%多聚甲醛溶液中，4℃固定24 h，固定后的標(biāo)本經(jīng)常規(guī)脫水、透明、石臘包埋切片(厚度為4 μm)，用于免疫組化染色，計(jì)數(shù)MVD。取潰瘍及潰瘍旁胃組織，稱重，加一定量生理鹽水(含50 U/mL的抑肽酶)，用勻漿器充分勻漿，離心(3 000 r/min，20 min)，取上清液，－20 ℃低溫保存，用于ELISA檢測。

MVD測定 采用CD34標(biāo)記的免疫組化染色法(SP法)。微血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)被染成棕黃色，以單個血管內(nèi)皮細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞簇為一個血管標(biāo)記，管徑大于8個紅細(xì)胞直徑者不計(jì)。先于低倍鏡(×100)下確定血管密度最高區(qū)，再于高倍鏡(×400)下選擇5個視野進(jìn)行微血管數(shù)目計(jì)數(shù)，取平均值，用每高倍視野(High-power field，HP)微血管數(shù)來表示 MVD［5－6］。

VEGF-A165及ES水平測定 取胃黏膜組織勻漿上清液，以紫外吸收法(280 nm)測定組織蛋白濃度，以VEGF-A165 ELISA試劑盒及ES ELISA試劑盒分別測定VEGF-A165及ES含量，結(jié)果以pg/mg蛋白表示。測試步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Stata7．0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以±s差表示。多樣本間均數(shù)比較采用單因素方差分析。兩樣本ES濃度比較采用t檢驗(yàn)，VEGF-A165濃度比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。兩變量間相關(guān)分析:ES與MVD采用Pearson相關(guān)分析，VEGF-A165與MVD采用Spearman相關(guān)分析。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

氯吡格雷對大鼠胃潰瘍愈合的影響 制模術(shù)后第3天潰瘍面積為(25．17±3．06)mm2。制模術(shù)后第10天，氯吡格雷組和生理鹽水組潰瘍面積分別為(11 ±3．07)mm2和(7 ±1．85)mm2，與 第3天相比均顯著縮小(P＜0．01)，但氯吡格雷組潰瘍面積是生理鹽水組的1．6倍(P=0．023 0)，說明氯吡格雷可顯著延緩潰瘍愈合(圖1、2)。

氯吡格雷對潰瘍底部MVD的影響 制模術(shù)后第10天潰瘍底部MVD定量分析提示:氯吡格雷組MVD(6．8 ±1．8/HP)顯著低于生理鹽水組(9．9 ±2．3/HP，P=0．011 4)，可見氯吡格雷能夠明顯抑制潰瘍底部的微血管形成(圖3)。

氯吡格雷對胃黏膜VEGF-A165及ES表達(dá)的影響 制模術(shù)后第10天氯吡格雷組胃黏膜VEGF-A165含量顯著低于生理鹽水組(P＜0．01);ES含量顯著高于生理鹽水組(P＜0．01，表1)。

圖1 氯吡格雷對大鼠胃潰瘍愈合的影響Fig 1 Effect of clopidogrel on healing of gastric ulcers in rats

圖2 潰瘍大體標(biāo)本Fig 2 Ulcer specimens

圖3 潰瘍底部微血管CD34免疫組化染色(×100)Fig 3 Effect on MVD at the bottom of ulcers by clopidogrel(×100)

表1 氯吡格雷對VEGF-A165及ES的影響Tab 1 Effect on the expression of VEGF-A165 and ES by clopidogrel

MVD與VEGF-A165、ES的相關(guān)性 潰瘍底部MVD與胃黏膜VEGF-A165含量正相關(guān)(P=0．003 2)，與胃黏膜ES 含量負(fù)相關(guān)(P=0．000 5，表2、圖4)。

表2 MVD與VEGF-A165和ES的相關(guān)性Tab 2 The correlation between MVD and VEGF-A165 or ES

圖4 MVD與VEGF-A165、ES的散點(diǎn)圖Fig 4 The scatter diagram of MVD and VEGF-A165 or ES

討 論

本研究觀察到氯吡格雷10 mg/kg可顯著延緩乙酸性大鼠胃潰瘍愈合。在此基礎(chǔ)上，我們對氯吡格雷延緩胃潰瘍愈合的機(jī)制作了進(jìn)一步研究。在胃潰瘍愈合過程中，潰瘍底部肉芽組織生長主要依賴血管生成過程形成新生微血管網(wǎng)，微血管形成過程受阻必然導(dǎo)致潰瘍愈合延緩［7］。現(xiàn)有資料提示［8－9］:乙酸性胃潰瘍制模術(shù)后第1～3天，是炎癥高峰期，潰瘍底部微血管數(shù)量很少，此時潰瘍局部組織內(nèi)微血管形成機(jī)制尚未全面啟動，隨后進(jìn)入潰瘍愈合階段，微血管的形成顯著增加。為了觀察氯吡格雷對胃潰瘍底部微血管形成的影響，我們采用CD34單克隆抗體對微血管進(jìn)行了免疫組化染色。結(jié)果顯示制模術(shù)后第10天，氯吡格雷組MVD顯著低于生理鹽水組，說明氯吡格雷可以明顯抑制潰瘍底部的微血管形成。

血管生成通常是由正負(fù)調(diào)控因子來調(diào)節(jié)的，正調(diào)控因子促進(jìn)血管形成和生長，而負(fù)調(diào)控因子則起抑制作用。VEGF是目前發(fā)現(xiàn)的最重要的促血管生成因子之一［10］。在正常成人和動物的多數(shù)組織中表達(dá)較少，在有新生血管生成的組織細(xì)胞中呈高表達(dá)，尤其在腫瘤組織中。VEGF-A基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄水平剪切可產(chǎn)生 5種異構(gòu)體，分別包括 121、145、165、189和 206個氨基酸。VEGF-Al65是主要的效應(yīng)分子，缺乏外顯子6編碼的產(chǎn)物，有肝素結(jié)合位點(diǎn)，既可以分泌到細(xì)胞外也可以結(jié)合在細(xì)胞表面或細(xì)胞外基質(zhì)，與基質(zhì)結(jié)合的VEGF-Al65經(jīng)過纖溶酶在C末端的剪切也可以釋放出來［10］，其與受體結(jié)合后發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。VEGF-A主要結(jié)合在兩類酪氨酸激酶受體上，VEGFR-1(flt-1)和 VEGFR-2(KDR/flk-1)，其中 KDR起主要作用。KDR激活后引起內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂、增殖和遷移，使新生血管形成和血管通透性增加。ES是最有效的內(nèi)源性血管生成抑制劑，由184個氨基酸組成，是血管周圍基底膜部位的膠原XⅧ羧基末端的一個酶解片段。成人體內(nèi)的膠原XⅧ主要在肝臟中表達(dá)，主要是由肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生。新生血管內(nèi)皮細(xì)胞中也有膠原XⅧ表達(dá)。ES作為內(nèi)源性抗血管生成物質(zhì)，可通過阻斷VEGF介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑，特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，特別是微血管的內(nèi)皮細(xì)胞，抑制其遷移并誘導(dǎo)凋亡，從而抑制血管生成［11－12］。

現(xiàn)有資料表明:乙酸性胃潰瘍自發(fā)愈合階段血清及潰瘍周圍黏膜組織VEGF升高、血清ES降低，潰瘍底部的微血管形成增多［5，13］。向潰瘍基底部注射質(zhì)粒編碼VEGF-A165可顯著加強(qiáng)血管生成，促進(jìn)潰瘍愈合［14］。本研究發(fā)現(xiàn)大鼠胃潰瘍底部MVD與胃黏膜VEGF-A165含量正相關(guān)，與胃黏膜ES含量負(fù)相關(guān)，推測VEGF-A165及ES對大鼠胃潰瘍愈合過程中微血管生成起調(diào)節(jié)作用。制模術(shù)后第10天氯吡格雷組胃黏膜VEGF-A165含量顯著低于生理鹽水組，ES含量顯著高于生理鹽水組，MVD顯著低于生理鹽水組，提示氯吡格雷可抑制胃黏膜VEGFA165表達(dá)，同時上調(diào)胃黏膜ES水平，從而影響胃潰瘍底部的微血管生成，使胃腸道損傷黏膜難以修復(fù)，甚至發(fā)生消化道出血等嚴(yán)重并發(fā)癥。這與有潰瘍病史患者服用氯吡格雷出血率高是一致的［3］。本研究顯示:氯吡格雷對實(shí)驗(yàn)性大鼠胃潰瘍愈合具有顯著的延緩作用，推測可能是通過調(diào)節(jié)胃黏膜VEGFA165、ES的表達(dá)以抑制胃潰瘍底部的微血管形成。

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