陳世瓊，逄波，蔡雪鳳，伊鋆，郭錚蕾，付浦博，饒紅

1(國(guó)家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心，北京，100094)2(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心，北京，1022062)

3(北京市出入境檢驗(yàn)檢疫局，北京，100026)

近幾年來(lái)，由于食品防腐劑和輻照技術(shù)的普遍應(yīng)用，造成酵母菌引起的食品腐敗問(wèn)題越來(lái)越多。此外，在低pH 值、低水活性、低濕度、含鹽量或含糖量高的食品中，由于酵母菌的抵抗力較強(qiáng)，其食品腐敗也多由酵母菌引起。食品腐敗不僅造成經(jīng)濟(jì)損失，而且給消費(fèi)者的健康帶來(lái)威脅。容易發(fā)生酵母菌腐敗的產(chǎn)品有發(fā)酵食品、腌漬食品、濃縮果汁、蜂蜜、果醬、肉、海產(chǎn)食品、奶制品、焙烤食品、飲料等。

釀酒酵母、魯氏接合酵母、斯巴達(dá)克畢赤酵母和布魯塞爾德克酵母等在食品中的殘留均可導(dǎo)致食品腐敗。其中，魯氏接合酵母是最常見(jiàn)的嗜滲酵母，常引起糖漿、果醬、果汁等高糖食品的變質(zhì)［1－7］。釀酒酵母是常見(jiàn)的導(dǎo)致果汁腐敗的酵母［8－10］。其他酵母導(dǎo)致食品腐敗的事件也有報(bào)道。本文針對(duì)釀酒酵母、魯氏接合酵母、斯巴達(dá)克畢赤酵母和布魯塞爾德克酵母的基因保守序列，設(shè)計(jì)或篩選實(shí)時(shí)熒光PCR 鑒定用的探針引物，建立了針對(duì)這4 種酵母的實(shí)時(shí)熒光PCR 鑒定方法，并用所建立的方法對(duì)分離自市售食品的未知酵母進(jìn)行了鑒定。實(shí)時(shí)熒光PCR 方法鑒定酵母，全過(guò)程僅需約3 h，與常用的生化鑒定方法相比，實(shí)時(shí)熒光PCR 方法簡(jiǎn)化了鑒定步驟，提高了鑒定準(zhǔn)確性，縮短了鑒定時(shí)間。

1 材料與方法

1.1 菌株

本研究使用的菌株見(jiàn)表1。

表1 本研究使用的菌株Table 1 Strains used in this study

其中，編號(hào)為1 ～4 的釀酒酵母、魯氏接合酵母、布魯塞爾德克酵母及斯巴達(dá)畢赤酵母為目的標(biāo)準(zhǔn)菌株;5 ～13 為參比菌株，其中，10 為黑曲霉(ATCC 16404)，11 ～13 為細(xì)菌，其他食品中常見(jiàn)的其他腐敗酵母。14 ～75 為分離自蜂蜜、糕點(diǎn)、水或飲料的未知酵母。

1.2 儀器及試劑

實(shí)時(shí)熒光PCR 儀(ABI 7300);生化培養(yǎng)箱。

反應(yīng)預(yù)混液(2 ×TaqMan Universal Master Mix，ABI)(Cat. No. :4427788);酵母基因組提取試劑盒(Cat. :No. :DP 307 －02)，天根生化科技有限公司(以下簡(jiǎn)稱天根公司);細(xì)菌基因組提取試劑盒(Cat. No. :DP 302 －02)，天根公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株的培養(yǎng)及DNA 提取

將表1 中的菌株用表2 中的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件培養(yǎng)，取培養(yǎng)液用天根公司酵母或細(xì)菌基因組提取試劑盒提取DNA。

表2 本研究使用菌株的培養(yǎng)條件Table 2 Culture conditions used in this study

1.3.2 探針、引物的設(shè)計(jì)、選擇及檢測(cè)方法的建立

(1)探針、引物的設(shè)計(jì)及合成

釀酒酵母的探針、引物由文獻(xiàn)［13］查得。魯氏接合酵母、布魯塞爾德克酵母及斯巴達(dá)畢赤酵母的探針、引物根據(jù)其ITS1、5.8 S、ITS2 序列設(shè)計(jì)。所有引物、探針均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

(2)實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)方法的建立

分別以表1 中目的菌株和參比菌株(1 ～13)的DNA 為模板，配制20 μL 實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)體系，組成如下:含10 μL 2 ×TaqMan Universal Master Mix，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，探針(10 μmol/L)1 μL，模板50 ～100 ng，用滅過(guò)菌的雙蒸水補(bǔ)足至20 μL。在ABI 7300 擴(kuò)增，根據(jù)Ct 值判斷探針、引物的有效性和特異性。4 種目的酵母的實(shí)時(shí)熒光PCR 擴(kuò)增條件見(jiàn)表3。

表3 實(shí)時(shí)熒光PCR 鑒定方法的擴(kuò)增條件Table 3 Amplification conditions of real-time PCR identification method

(3)實(shí)際樣品中分離出的未知酵母菌的鑒定

分別使用針對(duì)不同目的菌株的探針、引物，以表1 中未知菌株的DNA 為模板，配制20 μL 實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)體系，組成如下:含10 μL 2 ×TaqMan Universal Master Mix，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，探針(10 μmol/L)1 μL，模板50 ～100 ng，用滅過(guò)菌的雙蒸水補(bǔ)足至20 μL。在ABI 7300 上擴(kuò)增，根據(jù)Ct值判斷未知酵母是否是所要鑒定的酵母菌。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 實(shí)時(shí)熒光PCR 法鑒定4 種腐敗酵母探針、引物的有效性及特異性實(shí)驗(yàn)

篩選或設(shè)計(jì)的針對(duì)4 種腐敗酵母鑒定用的探針、引物的有效性及特異性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 針對(duì)4 種腐敗酵母實(shí)時(shí)熒光PCR 法鑒定用的探針、引物的有效性及特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Effectiveness and specificity of the probes and primers for the 4 kinds of spoilage yeast

從表4 可以看出，本研究所設(shè)計(jì)或篩選的針對(duì)釀酒酵母、魯氏接合酵母、布魯塞爾德克酵母及斯巴達(dá)畢赤酵母實(shí)時(shí)熒光PCR 探針和引物對(duì)目的菌株有高度的特異性，在本研究所使用的擴(kuò)增條件下，4 種目的菌株的擴(kuò)增曲線的Ct 值分別為21.07、28.60、25.50 和24.04，其他酵母、曲霉和細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株或參比菌株擴(kuò)增曲線的Ct 值均顯示為“UNDETECT”。說(shuō)明所使用的引物和探針對(duì)各自的目標(biāo)酵母菌具有特異性。

2.2 分離自樣品的未知酵母實(shí)時(shí)熒光PCR 方法快速鑒定

分別使用針對(duì)釀酒酵母、魯氏接合酵母、布魯塞爾德克酵母及斯巴達(dá)畢赤酵母實(shí)時(shí)熒光PCR 方法鑒定用的探針和引物，以分離自食品樣品的60 余株未知酵母的DNA 為模板，使用ABI 公司生產(chǎn)的反應(yīng)預(yù)混 液(2 ×TaqMan Universal Master Mix，ABI)(Cat. No. :4427788)配制20μL 反應(yīng)體系，使用表3中的擴(kuò)增條件，對(duì)分離自食品樣品的60 余株未知酵母進(jìn)行快速鑒定。

鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，編號(hào)為10 －1、10 －2、10 －3 及10 －5 的4 株菌為釀酒酵母，他們均分離自果汁飲料。另外，有21 株為魯氏接合酵母，其實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)Ct 值均在24 ～29 之間，全部分離自蜂蜜樣品。60 余株未知酵母中的約35 株為與釀酒酵母、魯氏接合酵母、布魯塞爾德克酵母及斯巴達(dá)畢赤酵母不同的酵母菌，有待進(jìn)一步鑒定。

［1］ Saksinchai S，Suzuki M，Chantawannakul P，et al.A novel ascosporogenous yeast species，Zygosaccharomyces siamensis，and the sugar tolerant yeasts associated with raw honey collected in Thailand［J］． Fungal Diversity，2012，52(1):123 －139.

［2］ Shneider A，Horn H，Hammes W P.The occurrence of osmophilic yeasts in honey［J］． Dtsch Lebensm-Rundsch，2003，99(8):310 －319.

［3］ Park Y K，KOO M H，De Aguiar Oliveira I M.Biochemical characteristics of osmophilic yeasts isolated from pollens and honey［J］． Bioscience，Biotechnology and Biochemistry，1996，60(11):1 872 －1 873.

［4］ Sule Senses-Ergul，Zekiye Yesim Ozbas. Characterization of the yeast flora present in some Turkish high-sugar products［J］． J Gen Appl Microbiol，2006，52(2):99 －106.

［5］ Taing O K，F(xiàn)umio Hashinaga. Identification of sugar-tolerant yeasts isolated high-sugar fermented vegetable extracts［J］． J Gen App Microbiol，1997，43(1):39 －47 .

［6］ TY KOH. The isolation of obligate osmophilic mutants of the yeastSaccharomyces rouxii［J］． Journal of General Microbiology，1975，88:184 －188.

［7］ Maria Jose?Leandro，1，2 Hana Sychrova?，2 Catarina Prista1 and Maria C. Loureiro-Dias. The osmotolerant fructophilic yeastZygosaccharomyces rouxiiemploys two plasmamembrane fructose uptake systems belonging to a new family of yeast sugar transporters［J］． Microbiology，2011，157:601 －608.

［8］ 胡斌，錢和. 釀酒酵母菌含量對(duì)控制橙汁腐敗的影響［J］． 食品工業(yè)科技，2009，30(1):186 －188.

［9］ Tournas V H，Heeres J，Burgess L. Moulds and yeasts in fruit salads and fruit juices ［J］． Food Microbiology，2006，23(7):684 －688.

［10］ 陳瑤，賴崇德，劉玄，等. 橙汁釀酒酵母菌株的分離篩選和發(fā)酵性能的測(cè)定［J］． 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，29(4):665 －669.

［11］ 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部，GB 4789.10 －2010，《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》［S］，北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010

［12］ 陳世瓊，曹寶森，蔡雪鳳，等. 脂環(huán)酸芽孢桿菌的培養(yǎng)基篩選及優(yōu)化［J］． 中國(guó)釀造，2011(2):158 －160.

［13］ Francisco Salinas，Daniel Garrido，Angelica Ganga，et al. Taqman real-time PCR for the detection and enumeration ofSaccharomyces cerevisiaein wine［J］． Food Microbiology，2009，26(3):328 －332.