宋春麗，任健1，，馬翠翠1，

1(齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，哈爾濱 齊齊哈爾，161006)

2(齊齊哈爾大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工黑龍江省普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 齊齊哈爾，161006)

甲殼素是一種自然界生物合成量位居第二的天然高分子聚合物，它的基本結(jié)構(gòu)單位是β-1，4-N-乙酰-氨基葡萄糖。甲殼素的脫乙?；a(chǎn)物稱為殼聚糖，該物質(zhì)具有生物可降解性、生物相容性、鎮(zhèn)痛等諸多良好的功能特性，在醫(yī)藥、食品、廢水處理等多個(gè)行業(yè)中廣泛應(yīng)用［1－2］。目前，主要是以蝦蟹殼為原料生產(chǎn)殼聚糖，但是由于原料受地域和季節(jié)影響［3］，因而人工養(yǎng)殖的蠅蛆殼為殼聚糖的生產(chǎn)原料倍受關(guān)注，不僅是因?yàn)橄壡鶜さ募讱に睾扛?30% ～54.8%)、品質(zhì)好(色素及鈣鹽含量少)，更重要的是可以減少對環(huán)境的污染［4］。

殼聚糖氨基含量和分子質(zhì)量和相對分子質(zhì)量對功能性質(zhì)，如抑菌性等影響很大［5］，本文采用凝膠層析(SephacrylTMS-300)對蠅蛆殼聚糖的進(jìn)行分級純化，得到不同相對分子質(zhì)量的組分，并對分離的組分進(jìn)行紅外光譜分析和X-射線衍射分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與實(shí)驗(yàn)儀器

蠅蛆殼，取自齊齊哈爾市建華區(qū)齊佳生態(tài)養(yǎng)殖專業(yè)合作社;蠅蛆殼殼聚糖，實(shí)驗(yàn)室自制，制備方法見文獻(xiàn)［6］，脫乙酰度為79.45%;SephacrylTMS-300，GE Health 公司;D-氨基葡萄糖，上海伯奧生物科技公司;其余試劑均為分析純。

電熱恒溫水浴鍋(DK-98-Ⅱ型)，天津市泰斯特儀器有限公司;離心機(jī)(TDL-5-A 型)，上海安亭科學(xué)儀器廠;高效液相色譜儀(Agilent 1200 型)，美國安捷倫;TSK-GEL G-6 000 PWxL 柱、TSK-GEL G-3 000PW xL柱(7.8 mm×300 mm)，上海錦華層析設(shè)備廠;X-射線衍射儀(D8-FOCUS 型)，德國布魯克公司;傅里葉變換紅外光譜儀(Spectrum One 型)，美國PE 公司。

1.2 殼聚糖的凝膠層析分離純化

稱取一定量的蠅蛆殼殼聚糖，溶于體積分?jǐn)?shù)1%乙酸溶液中，上SephacrylTMS-300 柱(1.6 cm ×100 cm)分離，采用0.05 mol/L 乙酸-乙酸鈉緩沖液洗脫，上樣量為15 mL(濃度為5 mg/mL)，流速為0.5 mL/min，每管收集5 mL。

1.3 殼聚糖的純度鑒定

采用高效凝膠滲透色譜法測定。儀器為Agilent 1200，配備示差折光檢測器，層析柱為TSK-GEL G-6 000 PWxL 柱(7.8 mm ×300 mm)與TSK-GEL G-3 000 PW xL 柱(7.8 mm×300 mm)串聯(lián);流動相為水(pH 6.0)，流速1.0 mL/min;柱溫25 ℃;進(jìn)樣量20 μL。

1.4 殼聚糖理論氨基葡萄糖含量及純度的計(jì)算

殼聚糖的實(shí)測氨基葡萄糖含量的測定:取濃度為0.125 ～1.0 g/L 的標(biāo)準(zhǔn)氨基葡萄糖溶液0.8 mL，加入1 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)1 % 間苯二酚水溶液，7.5 mL H2SO4，混勻，沸水浴加熱30 min，冷卻至室溫，加水至10 mL，混勻。以試劑空白為對照，測定490 nm 處吸光值，得濃度和吸光值的關(guān)系曲線。殼聚糖酸水解后測定其氨基葡萄糖含量，測定方法同上。

殼聚糖的純度可以定義為:殼聚糖實(shí)測氨基葡萄糖含量與理論氨基葡萄糖含量的比值。理論氨基葡萄糖含量和殼聚糖的純度的計(jì)算:

1.5 殼聚糖的相對分子質(zhì)量測定

采用黏度法測定殼聚糖的相對分子質(zhì)量。精確稱取恒重的殼聚糖樣品1 g，將其溶于50 mL 乙酸-氯化鈉溶劑中(0.1 mol/L 乙酸;0.2 mol/L 氯化鈉)。采用烏氏黏度計(jì)測定25℃時(shí)殼聚糖的黏度，然后利用公式計(jì)算殼聚糖的相對分子質(zhì)量。

其中:η 為比濃黏度;ηsp 為增比黏度;ηs 為溶劑黏度;η0 為樣品黏度。

相對分子質(zhì)量計(jì)算公式:

其中:K 和α 是常數(shù)，K = 1.424 × 10－3，α =0.96，M為相對分子質(zhì)量。

1.6 殼聚糖的結(jié)構(gòu)分析

1.6.1 殼聚糖的紅外光譜分析

分別稱取干燥的殼聚糖樣品，KBr 研磨壓片后，采用傅里葉變換紅外光譜儀掃描分析，掃描范圍400～4 000 cm－1。

1.6.2 殼聚糖的X-射線衍射分析

根據(jù)參考文獻(xiàn)［7］，將樣品研磨、烘干、過200 目篩，制片，采用全自動X-射線衍射儀測定。以Cu 靶Kαl(40 kV，20 mA)作為射線源，以4.5°/min 的掃描速率從1°掃描到40°。

2 結(jié)果與討論

2.1 殼聚糖氨基葡萄糖含量及純度測定

殼聚糖組分1 和組分2 在TSK 上的色譜分布圖見圖1。

圖1 殼聚糖組分1(A)和組分2(B)在TSK 柱上的色譜圖Fig.1 Molecular weight distribution of two prepared fractions of chitosan on TSK column

從圖1 可以看出，組分1 和組分2 都是單一峰，說明二者相對分子質(zhì)量分布比較均一，這初步證實(shí)了這組分的純度較高。

通過測定殼聚糖理論氨基葡萄糖含量，進(jìn)而計(jì)算殼聚糖的純度。標(biāo)準(zhǔn)氨基葡萄糖濃度與490 nm 的吸光值的關(guān)系曲線為y= 0.216 4x－ 0.000 1(R2=0.998 5)，測定殼聚糖組分1 和組分2 的氨基葡萄糖含量，計(jì)算得出，殼聚糖組分1 和組分2 的純度分別為98.5%和98.2%。

2.2 殼聚糖相對分子質(zhì)量的測定

根據(jù)殼聚糖黏度與相對分子質(zhì)量之間的關(guān)系計(jì)算殼聚糖的相對分子質(zhì)量，測定組分1 和組分2 的相對分子質(zhì)量分別為620 和230 kDa。

2.3 殼聚糖組分的紅外光譜分析

殼聚糖組分1 和組分2 的紅外光譜圖見圖2。

圖2 商品殼聚糖和殼聚糖組分1、組分2 的紅外光譜圖Fig.2 FTIR spectra of two prepared fractions of chitosan and commercial chitosan

從圖2 可以看出，組分1 和組分2 在3 600 ～3 200 cm－1為O—H 的伸縮振動;3 200 ～2 800 cm－1為C—H 的伸縮振動;1 400 ～1 200 cm－1之間出現(xiàn)的C—H 的伸縮振動，這些吸收峰都是糖類的特征吸收峰［8］。組分1 的高頻區(qū)吸收峰偏高(2 922.86 cm－1)，這可能是其結(jié)晶度低所造成的，結(jié)晶度低的原因是脫乙酰度較低。而組分1 在1 564.37 ～1 590.15 cm－1酰胺II 譜帶吸收峰比組分2 弱，說明組分1 的脫乙酰度較低。

與商品殼聚糖的紅外光譜圖比較，組分1 和組分2 均在1 013 cm－1(C6—OH 特征吸收峰)和1 120 cm－1附近(C3—OH 特征吸收峰)有較強(qiáng)的吸收峰，說明三者都是甲殼素的衍生產(chǎn)物。

2.4 殼聚糖組分的X-射線衍生分析

商品殼聚糖和殼聚糖組分1、組分2 的X-射線衍射圖譜見圖3。

圖3 商品殼聚糖(A)和殼聚糖組分1(B)、組分2(C)的X-射線衍射圖譜Fig. 3 X-ray diagram of two prepared fractions of chitosan and commercial chitosan

從圖3 可以看出，組分1 和組分2 的衍射峰與商品殼聚糖的衍射峰位置類似，均在2θ = 10.27°、15.73°、19.84°附近出現(xiàn)。但組分1 和組分2 在2θ=10°左右的衍射峰幾乎消失，說明分子間的作用力比較弱。此外，組分1 在2θ =15°附近的衍射峰較強(qiáng)，在2θ=20°附近的衍射峰很微弱，說明組分1 的結(jié)晶度不高，這與紅外分析結(jié)果一致;組分2 與商品殼聚糖的曲線類似，在2θ =20°時(shí)衍射峰型較尖銳，說明結(jié)晶度較高。

3 結(jié)論

采用SephacrylTMS-300 分離蠅蛆殼聚糖，得到了相對分子質(zhì)量分別為230 和620 kDa 的2 個(gè)組分。高效液相色譜顯示兩組分均達(dá)到了較高的純度。純度分析表明兩組分純度分別為98.5%和98.2%。在紅外光譜圖中2 組分均出現(xiàn)了殼聚糖官能團(tuán)的特征吸收峰;組分1 結(jié)晶度不高，組分2 結(jié)晶度較高。

［1］ Aranaz I，Mengíbar M，Harris R，et al. Functional characterization of chitin and chitosan［J］. Current Chemical Biology，2009，3(2):203 －230.

［2］ 滕麗菊，張子勇，唐書澤，等. 殼聚糖的抗菌活性研究［J］. 中國調(diào)味品，2008，33(10):48 －51.

［3］ 蔣挺大. 甲殼素［M］. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2003，3:246 ～247.

［4］ 賀繼東，夏文水. 工程蠅蛆的開發(fā)利用和深度加工［J］． 食品工業(yè)科技，2002，23(12):90 －93.

［5］ 王岸娜，王璋，許時(shí)嬰. 離子交換層析色譜法分離殼聚糖［J］. 無錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，22(6):75 －80.

［6］ 馬翠翠，任健. 蠅蛆殼制備殼聚糖的工藝條件研究［J］． 現(xiàn)代食品科技，2013，29 (2):331 －334.

［7］ Yen M T，Yang J H，Mau J L. Physicochemical characterization of chitin and chitosan from crab shells［J］. Carbohydrate Polymers，2009，75 (1):15 －21.

［8］ 姚惠源，胡敏，袁小平，等. 小麥麩皮阿魏酰低聚糖的分離純化與結(jié)構(gòu)分析［J］. 2009，30(3):79 －83.