查玉華，陳文霞，張鵬

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 附屬醫(yī)院，北京 100071

白細(xì)胞的遷移是炎癥發(fā)生過(guò)程中必不可少的步驟之一。在炎癥中，白細(xì)胞通過(guò)血管壁滲出到血管外并在炎癥部位聚集，稱為白細(xì)胞浸潤(rùn)。單核/巨噬細(xì)胞是浸潤(rùn)的主要白細(xì)胞之一[1]。浸潤(rùn)到組織間隙的單核/巨噬細(xì)胞能夠發(fā)揮其吞噬功能，殺滅侵入的病原體，修復(fù)創(chuàng)傷組織；但同時(shí)也釋放大量炎癥因子、自由基及溶酶體酶，導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂和組織細(xì)胞損傷[2]。因此，揭示巨噬細(xì)胞遷移的調(diào)控機(jī)制十分重要。

在細(xì)胞遷移過(guò)程中，磷脂酰肌醇激酶（phospha?tidylinositol-3-OH kinase，PI3K）的激活起關(guān)鍵作用。PI3K的激活導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)磷脂酰肌醇三磷酸［phosphatidylinositol-3，4，5-triphosphate，PI（3，4，5）P3］的產(chǎn)生，而 PI（3，4，5）P3則是細(xì)胞極化遷移過(guò)程中的樞紐物質(zhì)[3-4]。PI（3，4，5）P3 可募集包含 Pleck?strin Homolgy（PH）結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞骨架調(diào)控蛋白，啟動(dòng)細(xì)胞骨架重組，細(xì)胞產(chǎn)生極化進(jìn)而發(fā)生遷移[5]。PLEKHA1（PH domain-containing family A mem?ber 1）是包含PH結(jié)構(gòu)域蛋白超家族的一員，生物信息學(xué)分析表明其可能與PI（3，4，5）P3相結(jié)合[6]，但其對(duì)細(xì)胞遷移的調(diào)控作用未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在探討過(guò)表達(dá)PLEKHA1對(duì)巨噬細(xì)胞遷移的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

293FT和RAW264.7細(xì)胞，質(zhì)粒pCMV-Myc-PLEKHA1為本室保存；大腸桿菌DH5α感受態(tài)菌購(gòu)自依科賽公司；攜帶加強(qiáng)型綠色熒光蛋白（eGFP）基因的慢病毒載體pCDH、包裝質(zhì)粒pMD和SPA由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所蛋白質(zhì)組與基因組學(xué)研究室惠贈(zèng)；LipofectAMINE 2000購(gòu)自Invit?rogen公司；T4DNA連接酶、dNTP、PrimerSTAR HS高保真酶、DNA marker DL2000及限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ購(gòu)自大連寶生物公司；質(zhì)粒提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒DNA膠回收純化試劑盒購(gòu)自Promega公司；PLEKHA1抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；Transwell chambers購(gòu)自Corning公司；N-formyl-me?thionyl-leucyl-phenylalanine（fMLP，F(xiàn)3506）購(gòu)自 Sig?ma-Aldrich公司。

1.2 重組慢病毒載體的構(gòu)建

以pCMV-Myc-PLEKHA1為模板進(jìn)行PCR，上下游引物分別為P1（5'-TACGAATTCACATGCCTT ATGTGGATCGACA-3'）和 P2（5'-CGCGGCCGCTTC ACACATCGCTGACTGGCAG-3'）（循 環(huán) 參 數(shù) ：94℃30 s、68℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)）。純化后得到目的片段，經(jīng)雙酶切后重組入慢病毒載體pCDH，重組慢病毒載體經(jīng)雙酶切鑒定并測(cè)序。

1.3 慢病毒包裝

293FT包裝細(xì)胞（培養(yǎng)基為高糖DMEM添加10%胎牛血清，0.1 mmol/L NEAA，0.2 mol/L L-谷氨酰胺）培養(yǎng)至細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)接種，培養(yǎng)基中不加抗生素。以六孔板為例，總質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量為6 μg，分別為 pMD 1 μg、SPA 2 μg、pCDH-PLEKHA1 3 μg。轉(zhuǎn)染后第 2 d換液，每孔加2 mL，轉(zhuǎn)染后48 h再補(bǔ)2 mL；轉(zhuǎn)染后72 h收上清，用0.22 μm濾器過(guò)濾，-70℃保存或立刻使用。

1.4 RAW264.7細(xì)胞的感染及篩選

六孔板鋪細(xì)胞，被感染細(xì)胞的密度以4 d后長(zhǎng)滿為宜，病毒上清與完全培養(yǎng)基1∶1使用。4～5 d可見(jiàn)部分細(xì)胞發(fā)綠色熒光，此時(shí)用嘌呤霉素5 μg/mL處理24 h，然后換為新鮮的完全培養(yǎng)基，以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。

1.5 Western印跡

細(xì)胞用TNE裂解液［50 mmol/L Tris（pH7.4），150 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA，1%NP-40，加蛋白酶和磷酸酶抑制劑（Roche）］裂解，SDS-PAGE分離蛋白后電轉(zhuǎn)移至NC膜，用脫脂牛奶封閉液封閉1 h；加入一抗，室溫溫育2 h或4℃溫育過(guò)夜；用TBST洗膜3次，每次10 min；加入相應(yīng)的二抗，室溫溫育1 h；用TBST洗膜3次，每次10 min；將ECL顯色液加到膜上，用保鮮膜把膜包起來(lái)；暗室中X線膠片曝光，顯影、定影，流水沖洗X線膠片，干燥保存。

1.6 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

小室孔徑8 μm，直徑6.5 mm。將1×105細(xì)胞混懸于100 mL RPMI1640培養(yǎng)基中加入小室，下層培養(yǎng)孔加入1 nmol/L fMLP；24 h后用甲醇固定小室中細(xì)胞，再用結(jié)晶紫溶液（0.1%結(jié)晶紫，20%甲醇）染色10 min；將小室沖洗干凈，用棉簽擦掉小室內(nèi)側(cè)膜上的細(xì)胞；取下小室底膜，于載玻片上觀察拍照，隨機(jī)選取至少5個(gè)視野計(jì)數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以 x±s表示，兩組間比較用 t檢驗(yàn)，P＜0.05判斷為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組慢病毒載體的酶切鑒定及測(cè)序結(jié)果

以pCMV-Myc-PLEKHA1質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增PLEKHA1基因的重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ、NotⅠ雙酶切后可獲得1200 bp的目的片段（圖1）。測(cè)序結(jié)果表明目的片段與NCBI公布的序列一致（未示）。

2.2 Western印跡檢測(cè)穩(wěn)定表達(dá)PLEKHA1的RAW264.7細(xì)胞

RAW264.7細(xì)胞分別感染對(duì)照病毒和PLEKHA1表達(dá)病毒，經(jīng)嘌呤霉素篩選，連續(xù)傳代5次后收集細(xì)胞進(jìn)行Western印跡，以內(nèi)源抗體檢測(cè)。與對(duì)照組細(xì)胞相比，穩(wěn)定表達(dá)PLEKHA1的RAW264.7細(xì)胞的PLEKHA1蛋白表達(dá)水平提高近30倍（圖2），說(shuō)明穩(wěn)定表達(dá)小鼠PLEKHA1的RAW264.7細(xì)胞系構(gòu)建成功。

2.3 PLEKHA1抑制巨噬細(xì)胞遷移

圖1 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

穩(wěn)定表達(dá)小鼠PLEKHA1的RAW264.7細(xì)胞系構(gòu)建成功后，采用Transwell方法研究PLEKHA1對(duì)巨噬細(xì)胞遷移的影響。計(jì)數(shù)聚碳酸酯膜下表面的細(xì)胞數(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖3，PLEKHA1組穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)明顯低于對(duì)照組（46±7 vs 18±4，P＜0.05）。

圖2 Western印跡檢測(cè)PLEKHA1的表達(dá)

圖3 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

3 討論

遷移是細(xì)胞最古老的行為之一。單細(xì)胞生物覓食，多細(xì)胞生物的發(fā)育、創(chuàng)傷愈合以及免疫反應(yīng)無(wú)不需要細(xì)胞遷移的參與。巨噬細(xì)胞的遷移更是與免疫反應(yīng)直接相關(guān)。巨噬細(xì)胞遷移異常，與動(dòng)脈粥樣硬化、肥胖的發(fā)生密切相關(guān)[7-8]。因此，發(fā)現(xiàn)新的巨噬細(xì)胞遷移調(diào)控因子，對(duì)于深化對(duì)巨噬細(xì)胞相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展的認(rèn)識(shí)有重要作用。在本研究中，我們以小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)慢病毒介導(dǎo)的方法，獲得穩(wěn)定表達(dá)PH結(jié)構(gòu)域蛋白PLEKHA1的細(xì)胞株，并檢測(cè)了其遷移能力。結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞中過(guò)表達(dá)PLEKHA1能使其遷移能力減弱，提示PLEKHA1是一個(gè)新的巨噬細(xì)胞遷移調(diào)控因子。這一細(xì)胞株的建立，也為進(jìn)一步研究PLEKHA1在巨噬細(xì)胞相關(guān)病理生理過(guò)程中的作用及機(jī)制提供了模型。

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