周賢婧， 師彥平

(1.中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所中國科學(xué)院西北特色植物資源化學(xué)重點實驗室/甘肅省天然藥物重點實驗室，甘肅蘭州 730000;2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100039）

蜂蜜作為一種潛在的生物抗氧化［1，2］、抗菌［3］的功能性食品，其抗氧化能力不僅受黃酮多酚類化合物的影響，同時也受蜂蜜中氨基酸成分的影響，而且相關(guān)性強(qiáng)于多酚類化合物［4］。蜂蜜中氨基酸的含量和種類依蜂蜜的品種和花粉不同而異，盡管依據(jù)氨基酸含量不能完全鑒別蜜源，但是不同種類蜂蜜的氨基酸含量的差異在蜜源鑒別方面也能起到一定的作用［5，6］。

自動化分析氨基酸是采用陽離子交換色譜分離與柱后茚三酮衍生結(jié)合的方法實現(xiàn)的，最初用于分析蛋白質(zhì)中的氨基酸。隨后，人們不斷地發(fā)展新的氨基酸分析方法，如:氨基酸自動分析儀［7］、柱前衍生反相高效液相色譜法［8］、高效陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測法［9］、高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法［10］、高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法［11］等技術(shù)相繼應(yīng)用于氨基酸分析。這些方法發(fā)展成熟并廣泛用于生化、醫(yī)學(xué)、生物工程、農(nóng)業(yè)和食品等領(lǐng)域。但是大多會存在著試劑消耗多、操作成本高、分析方法復(fù)雜、分析時間長等問題。由于大部分氨基酸沒有紫外吸收，因此不能采用簡單、方便的直接紫外檢測，需進(jìn)行衍生化處理。目前使用的柱前衍生試劑主要有鄰苯二甲醛 (OPA）［12，13］、異硫氰酸苯酯(PITC）［14］、氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl）［15］、丹酰氯(Dansyl-Cl）［16］等。但衍生化反應(yīng)存在產(chǎn)物不穩(wěn)定、剩余試劑對檢測造成干擾、衍生化條件苛刻等局限性，而間接檢測可克服這些缺點［17－19］。

本文應(yīng)用高效毛細(xì)管電泳(HPCE）-間接紫外檢測法于11 min內(nèi)同時分離檢測了蜂蜜中9種游離氨基酸。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

安捷倫公司7100毛細(xì)管電泳儀(配二極管陣列檢測器），安捷倫化學(xué)工作站用于獲取和處理色譜數(shù)據(jù)。分離用未涂層熔融石英毛細(xì)管(內(nèi)徑75 μm，總長48.5 cm，有效長度40 cm，河北省永年光導(dǎo)纖維廠）;PB-10型酸度計(北京賽多利斯儀器有限責(zé)任公司）;KQ-250型超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器有限公司）;超純水由實驗室純水制備儀(上海淶科儀器有限公司）制備;分析級甲醇、煙酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉和鹽酸(天津化學(xué)試劑廠）;十六烷基三甲基溴化銨(CTAB）(北京化學(xué)試劑公司）;732強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;蜂蜜樣品購于超市。

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品:谷氨酸(Glu）、天冬氨酸(Asp）、賴氨酸(Lys）、甲硫氨酸(Met）、脯氨酸(Pro）、蘇氨酸(Thr）、異亮氨酸(Ile）、色氨酸(Trp）、絲氨酸(Ser）(純度均為99.5%，上海生工生物工程公司）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱量氨基酸對照品，溶于超純水，配制氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，其中 Trp質(zhì)量濃度為25 mg/L，其余8種氨基酸質(zhì)量濃度為100 mg/L。該溶液用于條件優(yōu)化實驗。

1.3 樣品處理

1.3.1 樹脂處理

將100 g陽離子樹脂置于潔凈的容器中，用清水漂洗，直到排水清澈為止。用水浸泡樹脂12～24 h，使樹脂充分膨脹。用樹脂體積2倍量的5%HCl溶液浸泡樹脂2～4 h，并不時攪拌。然后用純水洗滌樹脂，直至溶液的pH接近4，再用5%NaOH溶液處理，處理后用水洗至微堿性，再一次用5%HCl溶液處理，使樹脂變?yōu)闅湫?，最后用純水洗至pH=4、無氯離子即可。

1.3.2 蜂蜜樣品預(yù)處理

將蜂蜜在烘箱中恒溫40℃下干燥至恒重，置于廣口瓶中備用。準(zhǔn)確稱取膏體20.00 g，將其完全溶于30 mL超純水中，倒入陽離子交換柱中，用95 mL 4 mol/L氨水洗脫，洗脫液于60℃下濃縮至干，用超純水溶解定容至25 mL。進(jìn)樣前用0.45 μm微孔濾膜過濾。

1.4 電泳條件

毛細(xì)管柱活化后，在每天使用前依次用0.5 mol/L鹽酸沖洗5 min、0.5 mol/L NaOH沖洗5 min、超純水沖洗1 min、電泳緩沖液沖洗5 min;每次分離前用電泳緩沖液沖洗2 min。運行緩沖液為含有0.5 mmol/L十六烷基三甲基溴化銨、20 mmol/L煙酸、10%甲醇的10 mmol/L磷酸二氫鈉緩沖溶液(pH 10.2），運行緩沖液需要當(dāng)天配制。檢測波長為220 nm;分離溫度為20℃;進(jìn)樣量:在5 kPa壓力下進(jìn)樣5 s。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理

本實驗采用陽離子交換樹脂，能夠去除蜂蜜中的糖類物質(zhì)，減少樣品基質(zhì)對電泳的影響，并對氨基酸分析具有較好的純化作用。陽離子交換樹脂對無機(jī)陽離子有較好的吸附分離性能，其分離原理是α-氨基與樹脂上的磺酸基存在靜電作用。不同氨基酸的α-氨基的堿性存在微小差異，故可通過柱色譜分離。此外，文獻(xiàn)［20，21］表明，在配體交換色譜分離氨基酸時，氨基酸的側(cè)基與樹脂的骨架可能存在疏水作用，對柱色譜的分離也有一定的貢獻(xiàn)。

2.2 分離條件的優(yōu)化

2.2.1 緩沖液的選擇與優(yōu)化

毛細(xì)管電泳-間接紫外檢測是基于樣品注入后背景吸收添加劑吸光度的減小來定量的。背景吸收一般較大，因此保持基線穩(wěn)定是一個很大的挑戰(zhàn)。本實驗考察了磷酸二氫鈉濃度對分離效果的影響(見圖1），發(fā)現(xiàn)10 mmol/L磷酸二氫鈉緩沖液具有足夠的緩沖容量、良好的分離效果和較穩(wěn)定的基線。

圖1 NaH2PO4濃度對9種氨基酸遷移時間的影響Fig.1 Effect of NaH2PO4concentration on the migration time of the nine amino acids

文獻(xiàn)報道對氨基苯甲酸和對羥基苯甲酸均可作為緩沖液中的背景吸收添加劑［18］，但二者在高電壓下均會發(fā)生電極反應(yīng)，緩沖液變色。煙酸與對氨基苯甲酸和對羥基苯甲酸有類似的結(jié)構(gòu)，而含煙酸的緩沖液具有與文獻(xiàn)［18］報道的含對氨基苯甲酸緩沖液近似的分離效果，且不發(fā)生電極反應(yīng)，因此本文選擇煙酸作為背景吸收添加劑。煙酸的濃度對檢測靈敏度有一定的影響，我們考察了煙酸濃度為10～30 mmol/L時分析物的峰高變化，最終確定在運行緩沖液中添加20 mmol/L煙酸。

2.2.2 緩沖液pH的優(yōu)化

通常，緩沖液的pH是控制電滲流和決定被分析物離子狀態(tài)的一個重要參數(shù)。不同解離常數(shù)(pKa）的被分析物在一定的pH下的解離度不同，從而導(dǎo)致電泳遷移速度的不同，因此被分析物不同解離常數(shù)是實現(xiàn)分離的基礎(chǔ)。本實驗考察了pH值在9.0～10.7范圍內(nèi)變化時被分析物的遷移行為和峰形的變化。分析物遷移時間與pH的關(guān)系圖見圖2。當(dāng)pH為10.2時，所有分析物達(dá)到基線完全分離，故選擇緩沖液的pH為10.2。本實驗所分析的9種氨基酸中pKa最小的是蘇氨酸(pKa2=9.1），當(dāng)pH＜pKa1時，其帶正電;當(dāng)pH＞pKa2時，其帶負(fù)電;故選擇緩沖液的pH＞9。由于賴氨酸在pH=10.2的條件下依然帶正電，所以其在電滲流之后出峰，最先出峰的是谷氨酸和天冬氨酸。另外，不僅氨基酸的pKa影響其出峰時間，其相對分子質(zhì)量的大小也對出峰順序有影響。

圖2 緩沖液pH對9種氨基酸遷移時間的影響Fig.2 Effect of buffer pH on the migration time of the nine amino acids

2.2.3 進(jìn)樣方式

以100 mg/L質(zhì)量濃度的Asp和Trp為分析對象，考察進(jìn)樣方式對分離的影響。電動進(jìn)樣:在－10 kV下進(jìn)樣10～30 s;試驗結(jié)果表明，進(jìn)樣20 s的進(jìn)樣量適中，峰形較佳。壓力進(jìn)樣:在5 kPa下進(jìn)樣3～10 s。對比兩種進(jìn)樣方法在其他優(yōu)化條件下的進(jìn)樣量，發(fā)現(xiàn)采用壓力進(jìn)樣方式的進(jìn)樣量適中，且沒有進(jìn)樣組分歧視，故本文選擇在5 kPa下進(jìn)樣5 s。

2.2.4 十六烷基三甲基溴化銨濃度的優(yōu)化

在堿性條件下，氨基酸通常以陰離子的形式存在，在電泳過程中向陽極移動，與電滲流方向相反。加入陽離子表面活性劑CTAB后可改變毛細(xì)管壁的電荷密度，使電勢改變方向，從而改變電滲流的方向。此時，待測陰離子的電泳和電滲流方向相同，故可實現(xiàn)快速分離。同時CTAB的加入也抑制了氨基酸在管壁的吸附，降低了噪聲和基線的波動，提高了檢測靈敏度。在上述緩沖液條件下L-Met、L-Pro和L-Ile仍未能得到基線分離。考察了CTAB的濃度為0.05～1.5 mmol/L范圍變化對分離的影響，當(dāng)其濃度為0.05 mmol/L時，離子遷移時間長，峰寬大;增大CTAB的濃度，峰寬減小，分離效率增大;CTAB濃度大于1 mmol/L時，分離速度加快，但I(xiàn)le與Pro不能達(dá)到基線分離;當(dāng)CTAB濃度為0.5 mmol/L時，分離效率最好(見圖 3），故本文選擇 0.5 mmol/L的CTAB為電滲流改性劑。

圖3 CTAB濃度對目標(biāo)物遷移時間的影響Fig.3 Effect of CTAB concentration on the migration time of the analytes

為了改善遷移時間相近的幾組氨基酸(如Asp和Glu、Ile和Pro）的分離，本文考察了有機(jī)溶劑乙腈和甲醇對9種氨基酸分離度的影響，發(fā)現(xiàn)甲醇能顯著改善峰形，改善Asp和Glu的分離度，實現(xiàn)基線分離。但甲醇也有抑制電滲的作用，延緩出峰時間?？疾煸谶\行緩沖液中添加5%～20%(v/v）的甲醇后分析物的保留時間和峰形，發(fā)現(xiàn)添加10%的甲醇時分離效果較佳。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系、精密度與重現(xiàn)性

將9種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品儲備液用超純水配成質(zhì)量濃度為50、25、15、10 mg/L 的溶液，其中 Trp的質(zhì)量濃度為12.5、6.25、3.75、2.5 mg/L。不同濃度溶液依次進(jìn)樣，在最佳條件下進(jìn)行電泳分析測定。以各氨基酸的峰面積(Y）對其質(zhì)量濃度(X，mg/L）做線性回歸，得到的回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表1。以響應(yīng)值3倍于噪聲所對應(yīng)的濃度為檢出限，得到9種氨基酸的檢出限在0.3～1.5 mg/L范圍內(nèi)。該方法靈敏度高，可滿足樣品測定要求。在各自的線性范圍內(nèi)的線性相關(guān)系數(shù)范圍為0.9828～0.9999，表明線性關(guān)系良好。

表1 9種氨基酸的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢出限Table 1 Regression equations，correlation coefficients(r），linear ranges and limits of detection(LOD）of the nine amino acids

在5份相同蜂蜜樣品中添加氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液儲備液，按照1.3.2節(jié)的樣品處理方法，配制相同濃度供試品溶液5份，在最佳條件下，連續(xù)5日分析測定，由峰面積及遷移時間算得相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD）為日間精密度;一日內(nèi)連續(xù)分析同一濃度的溶液5次，由峰面積及遷移時間算得RSD為日內(nèi)精密度。由表2可見，峰面積精密度范圍在2.16%～5.83%，遷移時間精密度在0.64%～2.33%范圍內(nèi)，表明該方法精密度良好。

表2 被測組分的日內(nèi)及日間測定精密度Table 2 Intra-day and inter-day precision of the determination of the amino acids

以含20 mmol/L煙酸、0.5 mmol/L CTAB、10%甲醇的10 mmol/L NaH2PO4緩沖溶液(pH=10.2）為運行緩沖液，在－15 kV為分離電壓、檢測波長為220 nm條件下，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的電泳譜圖見圖4，其中Trp為25 mg/L，其余標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度均為100 mg/L。

圖4 9種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的電泳譜圖Fig.4 Electropherogram of a mixture of the nine amino acid standards

2.3.2 加標(biāo)回收率

從廣西荔枝蜂蜜樣品中取24份樣品，每份20 g，平均分為3組，每組樣品中分別加入原始量的80%、100%和120%的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液;按照建立的方法進(jìn)行樣品預(yù)處理與測定，考察了荔枝蜂蜜樣品內(nèi)含有的8種氨基酸的加標(biāo)回收率。由表3給出的結(jié)果可見，在上述3個加標(biāo)水平下，8種氨基酸的回收率在60.00%～118.2%之間，RSD在2.16%～9.87%之間。廣西荔枝蜂蜜的電泳譜圖見圖5。

圖5 廣西荔枝蜂蜜的電泳譜圖Fig.5 Electropherogram of litchi honey from Guangxi For peak identifications，see Fig.4.

表3 廣西荔枝蜂蜜中8種氨基酸的加標(biāo)回收率及精密度(n=9）Table 3 Recoveries and precisions of the eight amino acids spiked in litchi honey from Guangxi(n=9）

2.4 實際樣品的測定

選取了不同蜜源植物、不同產(chǎn)地的5種蜂蜜，分別是蘭州棗花蜜、景泰棗花蜜、陜西棗花蜜、廣西荔枝蜜和蘭州槐花蜜。由表4的結(jié)果可見，不同產(chǎn)地的相同蜜源植物的蜂蜜所含氨基酸的種類和含量有明顯差異。蜂蜜中游離氨基酸主要以脯氨酸為主，其中在荔枝蜜中含量最高，在洋槐蜜中含量則較低。在本實驗檢測的蜂蜜中均未檢出甲硫氨酸。

表4 蜂蜜樣品中氨基酸的含量Table 4 Contents of amino acids in honeys mg/kg

3 結(jié)論

本文測定的5種蜂蜜均屬于由天然原料加工而成的蜜蜂的采集物，但是由于采集原料不同，因此其氨基酸組成和含量有顯著差異。另外，由于蜜源植物的不同，同產(chǎn)地蜂產(chǎn)品的氨基酸組成也有顯著的差異，本文測定的不同蜂蜜產(chǎn)品之間的氨基酸總量和個體氨基酸的含量均有不同。蜂產(chǎn)品作為世界性的食療保健品，產(chǎn)品種類繁多，同時我國是世界植物資源最豐富的國家，蜜源植物更是有幾萬種。因此開展對不同種類蜂產(chǎn)品和蜜源植物不同的蜂產(chǎn)品的營養(yǎng)成分研究對于蜂產(chǎn)品的開發(fā)和利用有著重要的意義。

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