楊 蕾 唐成和

1）河南新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院 新鄉(xiāng) 453000 2）新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 衛(wèi)輝 453100

早產(chǎn)兒腦室周圍白質(zhì)軟化逐步增多，通過檢測NF－κBp65蛋白在腦室周圍白質(zhì)軟化大鼠中的表達(dá)變化，并與凋亡狀況進(jìn)行對比分析，探討其在腦室周圍白質(zhì)軟化中的作用，為早產(chǎn)兒腦室周圍白質(zhì)軟化防治提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1實驗對象研究對象選取100只健康新生SD大鼠，3日齡，無性別選擇，體質(zhì)量6～10g，完全隨機(jī)方法分為實驗組、對照組各50只；再進(jìn)一步將2組大鼠隨機(jī)分為6h、12h、24h、72h、7d組，每組10只，分別于大鼠足部貼上標(biāo)簽。各組大鼠日齡、體質(zhì)量指標(biāo)經(jīng)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2方法與觀察指標(biāo)將實驗組大鼠的單側(cè)頸總動脈結(jié)扎，并置于6%O2＋94%N2的氮氧混合器環(huán)境中4h，建立實驗動物模型。對照組僅分離單側(cè)頸總動脈，但不予結(jié)扎和缺氧處理。分別于術(shù)后6h、12h、24h、3d和7d對2組大鼠行心臟灌注，斷頭取腦制作成石蠟標(biāo)本［1－2］，顯微鏡下觀察標(biāo)本變化情況，TUNEL法檢測腦組織細(xì)胞凋亡狀況和免疫組化SABC法檢測NF－κBp65基因的蛋白表達(dá)變化；記錄2組大鼠的一般情況、體質(zhì)量、行為學(xué)變化等。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，全部結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。實驗組和對照組差異有無統(tǒng)計學(xué)意義采用兩獨立樣本t檢驗。不同時間點各組差異有無統(tǒng)計學(xué)意義采用方差分析，并進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1術(shù)后大鼠一般情況100只實驗大鼠中，對照組50只全部存活，實驗組50只死亡4只，存活率92%，明顯低于對照組（P＜0.05）。實驗組大鼠在一側(cè)頸動脈結(jié)扎后即出現(xiàn)不同程度的異常反應(yīng)，如皮膚蒼白或發(fā)紺、煩躁不安甚至抽搐，體質(zhì)量增長緩慢等異常表現(xiàn)。實驗組大鼠體質(zhì)量術(shù)后6h與同時間點對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。實驗組大鼠12h有體質(zhì)量下降，明顯低于對照組，術(shù)后12h、24h、72 h、7d與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 2組大鼠術(shù)后一般情況比較

2.2腦組織病理形態(tài)學(xué)改變大體觀察：實驗組大鼠病灶側(cè)大腦半球術(shù)后6～12h輕度水腫，以24h腦水腫最為明顯，病灶側(cè)則更顯著。大體觀察缺氧處理后72h水腫減輕，7 d可見腦萎縮及軟化。對照組大鼠未見明顯異常。病理觀察結(jié)果：光鏡下可見對照組側(cè)腦室旁白質(zhì)和胼胝體細(xì)胞排列有序，纖維組織明顯，胞核圓形淡染，兩側(cè)側(cè)腦室對稱，染色清晰。實驗組隨缺血缺氧時間延長病理改變呈動態(tài)變化。缺氧缺血12h側(cè)腦室旁白質(zhì)內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞胞體腫脹；24h鏡下可見星形膠質(zhì)細(xì)胞肥大、小膠質(zhì)細(xì)胞增生；72h可見側(cè)腦室旁白質(zhì)廣泛疏松；7d右側(cè)大腦側(cè)腦室旁白質(zhì)呈篩網(wǎng)狀壞死。

2.3細(xì)胞凋亡陽性率在腦損傷過程中的表達(dá)變化實驗組細(xì)胞凋亡陽性表達(dá)率隨時間變化動態(tài)變化，6h開始表達(dá)，此后逐步上升，72h達(dá)到峰值，7d細(xì)胞凋亡陽性率下降。對照組細(xì)胞凋亡陽性率各時間點無明顯變化。實驗組與對照組在6h、12h、24h、72h、7d五個觀察時間點比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。實驗組組間比較結(jié)果具體見表2。在陰性對照圖片中，未見陽性細(xì)胞。

2.4 NF－κBp65蛋白質(zhì)的表達(dá)變化實驗組和對照組大鼠腦組織均可見NF－κBp65蛋白質(zhì)的表達(dá)，對照組表達(dá)量少，且無明顯變化。實驗組缺氧后6h腦室周圍白質(zhì)NF－κBp65表達(dá)開始增加，12h、24h、72h組雖呈上升趨勢，但兩兩比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），7d達(dá)最高值。實驗組同對照組各個時間點的結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理均存在顯著差異。

表2 各時間點實驗組與對照組胼胝體區(qū)調(diào)亡細(xì)胞陽性率比較 （s）

表2 各時間點實驗組與對照組胼胝體區(qū)調(diào)亡細(xì)胞陽性率比較 （s）

注：表示與6h組比較，P＜0.05；▲表示與12h組比較，P＜0.05；★表示與24h組比較，P＜0.05；◆表示與3d組比較，P＜0.05；●表示與7d組比較，P＜0.05；對照組各時間點兩兩比較，P均＞0.05

F P實驗組 46 0.2216±0.0419★◆●0.2596±0.0133◆● 0.2925±0.0422◆ 0.3102±0.0422▲★●0.2887±0.0595▲◆ 10.806 ＜組別 n 6h 12h 24h 3d 7d 0.05對照組 50 0.0520±0.0007 0.0603±0.0006 0.0582±0.0005 0.0554±0.0010 0.0622±0.0008 1.326 ＞0.05 t 0.05 10.46 12.20 8.30 11.33 10.75 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜值

表3 不同時間點胼胝體區(qū)實驗組與對照組NF－κBp65蛋白平均光密度表達(dá)結(jié)果 （s）

表3 不同時間點胼胝體區(qū)實驗組與對照組NF－κBp65蛋白平均光密度表達(dá)結(jié)果 （s）

注：表示與6h組比較，P＜0.05；▲表示與12h組比較，P＜0.05；★表示與24h組比較，P＜0.05；◆表示與3d組比較，P＜0.05；●表示與7d組比較，P＜0.05；對照組各時間點兩兩比較，P均＞0.05

實驗組 46 4.220±0.990▲★◆● 6.865±0.690● 6.936±0.714● 7.235±1.010● 12.167±2.704▲★◆ 24.275 ＜0.05對照組 50 1.606±0.087 1.594±0.094 1.602±0.013 1.598±0.113 1.600±0.098 1.098 ＞0.05 t 0.05 6.468 18.712 18.3 13.671 9.573 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜值

2.5 NF－κBp65的表達(dá)水平與其細(xì)胞凋亡相關(guān)性分析腦室周圍白質(zhì)NF－κBp65的表達(dá)水平在腦損傷早期呈緩慢增高趨勢，7d時仍高表達(dá)，而細(xì)胞凋亡在72h表達(dá)陽性率最高，之后呈下降趨勢。二者相關(guān)性分析提示相關(guān)系數(shù)（r）為0.432（P＜0.05），呈正相關(guān)。

3 討論

腦室周圍白質(zhì)軟化可致嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥如腦性癱瘓、聽視覺障礙等，缺氧缺血是其病因之一。神經(jīng)細(xì)胞的凋亡可加重缺氧缺血后神經(jīng)損傷，是引起遲發(fā)性腦損傷的主要原因，臨床加重患兒神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥［3］。實驗顯示缺氧缺血后6h可見凋亡細(xì)胞，12h、24h明顯增多，72h凋亡指數(shù)達(dá)到最高，7d下降，與對照組比較各個時間點均有顯著差異，這與文獻(xiàn)報道缺氧缺血后48h達(dá)到高峰，72h明顯下降的變化趨勢基本一致，并且與本實驗蘇木精－伊紅染色所示病理改變的嚴(yán)重程度相對應(yīng)，提示細(xì)胞凋亡是新生大鼠腦白質(zhì)損傷的重要機(jī)制之一。

NF－κBp65在其與細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)信息傳遞并引發(fā)相應(yīng)的基因表達(dá)，從而產(chǎn)生一系列生理反應(yīng)。李鑫等的文獻(xiàn)指出，NF－κBp65存在于各類神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞中，在腦組織發(fā)生缺血缺氧進(jìn)而產(chǎn)生腦白質(zhì)病變的發(fā)生過程中，NF－κBp65通過多種途徑和環(huán)節(jié)參與其中。研究結(jié)果表明，在被研究的5個時間點范圍內(nèi)，實驗組大鼠NF－κBp65于術(shù)后6h起含量開始逐步提升，7d時最高。提示實驗組大鼠在經(jīng)過單側(cè)頸總動脈結(jié)扎后，腦部逐漸出現(xiàn)的缺血缺氧狀態(tài)刺激了NF－κBp65與IκB的脫離，提高腦白質(zhì)細(xì)胞的凋亡率。NF－κBp65對于氧化反應(yīng)具有較高的敏感性，也就是說，當(dāng)腦組織氧化反應(yīng)加強(qiáng)時，會進(jìn)一步誘導(dǎo)NF－κBp65的大量激活，并引導(dǎo)其參與到腦缺血后腦組織、腦神經(jīng)的損傷過程中。腦缺血后，腦內(nèi)由于缺血缺氧使氧化反應(yīng)受到抑制，并進(jìn)一步影響NF－κBp65的表達(dá)與被激活，從而減少了誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的mRNA表達(dá)，細(xì)胞內(nèi)活性氮和活性氧的產(chǎn)生減少，并有利于減少氧化應(yīng)激損傷［4］。

近年來，相關(guān)文獻(xiàn)證實，NF－κBp65為細(xì)胞凋亡的調(diào)控因子之一［5］。Chen等的相關(guān)研究提出，NF－κB對抗凋亡基因具有明顯的抑制作用，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。當(dāng)然，在這以前，已經(jīng)有很多研究者通過實驗驗證，NF－κB具有細(xì)胞凋亡抑制的作用。其可誘導(dǎo)抗凋亡基因Bcl－2和Bcl－XL等多種細(xì)胞凋亡抑制蛋白的表達(dá)。這兩種結(jié)論之間似乎存在著矛盾，但通過醫(yī)學(xué)界不斷的深入研究，最終發(fā)現(xiàn)NF－κB對于細(xì)胞凋亡的促進(jìn)或抑制與NF－κB亞單位的數(shù)量及種類有關(guān)。若亞基因RelA過表達(dá)時，NF－κB對細(xì)胞凋亡產(chǎn)生抑制作用，而當(dāng)c－RelA過表達(dá)時，NF－κB對細(xì)胞凋亡則起到促進(jìn)作用［6］。故本研究通過觀察NF－κBp65蛋白表達(dá)于細(xì)胞凋亡關(guān)系，為此方向研究提供依據(jù)。

在本實驗大鼠腦缺血缺氧的模型中，NF－κBp65呈現(xiàn)上升趨勢，并于7d達(dá)到高峰。實驗組大鼠在缺血缺氧的前提條件下，腦白質(zhì)細(xì)胞發(fā)生凋亡，術(shù)后6h細(xì)胞開始出現(xiàn)明顯凋亡，而3d時達(dá)到凋亡高峰。經(jīng)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，NF－κBp65與細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)。但72h內(nèi)呈顯著正相關(guān)，而72h后NF－κBp65仍持續(xù)高水平表達(dá)，與細(xì)胞凋亡有負(fù)相關(guān)趨勢，是否隨病情轉(zhuǎn)變體內(nèi)的傳導(dǎo)通路發(fā)生改變亦或NF－κBp65對凋亡的調(diào)控呈雙向作用需做進(jìn)一步研究證實。

［1］李德淵，陳娟，石晶，等 .新生大鼠腦室周圍白質(zhì)軟化模型的建立及評價［J］.中華婦幼臨床醫(yī)學(xué)雜志，2007，3（6）：320－325.

［2］袁寶莉，李瑞林，周戩平，等 .新生大鼠腦白質(zhì)損害模型的建立與評價［J］.新生兒科雜志，2004，19（1）：17－19.

［3］陳惠金 .早產(chǎn)兒腦室周圍白質(zhì)軟化的研究進(jìn)展［J］.實用兒科臨床雜志，2004，19（3）：83－86.

［4］胡文忠，王曉強(qiáng) .一氧化氮與一氧化氮合酶抑制劑對腦缺血后海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用［J］.中國實用神經(jīng)疾病雜志，2011，14（3）：10－12.

［5］張俊清，王偉，薛鋼，等 .急性缺血再灌注大鼠腦中γ－氨基丁酸A型受體α1mRNA的表達(dá)變化［J］.中國實用神經(jīng)疾病雜志，2010，13（1）：1－3.

［6］濮宏建，方黎明，朱歲軍，等.NF－κB在大鼠顱腦損傷后表達(dá)水平與細(xì)胞凋亡的關(guān)系［J］.中華創(chuàng)傷雜志，2009，25（10）：880－883.