趙天一,姜彤偉,張永和

（長春中醫(yī)藥大學(xué),吉林長春 130117）

鹿茸是名貴的動(dòng)物藥,多肽中含有多肽、多糖、生長因子等多種成分,近年來,有研究[1]顯示,鹿茸多肽對(duì)心肌缺血有保護(hù)作用,能減少心肌缺血面積,調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞膜和微粒體膜的穩(wěn)定性,避免鈣離子內(nèi)流引起細(xì)胞超負(fù)荷,以減輕心肌細(xì)胞損傷。但其對(duì)是否抑制細(xì)胞凋亡并不清楚。心肌梗死和急性心肌缺血等疾病與心肌的細(xì)胞凋亡有關(guān)[2],本實(shí)驗(yàn)通過觀察鹿茸多肽對(duì)心肌缺血大鼠心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2和Bax蛋白的影響,探討其對(duì)心肌缺血大鼠的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)Wistar大鼠,體質(zhì)量（220±20）g,60只,雌雄各半,由長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供,合格證號(hào)為:SCXK（吉）2011-0004。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 鹿茸多肽（分子量3 000 Da-10 000 Da）凍干粉,由長春中醫(yī)藥大學(xué)研發(fā)中心提供,批號(hào):20120302。維生素C丸,由東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司生產(chǎn),批號(hào):120301。注射用青霉素鈉,由華北制藥股份有限公司,批號(hào)為X1112413。Bcl-2和Bax蛋白酶聯(lián)免疫試劑盒由南京建成科技有限公司出品,批號(hào)為:20120603。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 FSH-2A型可調(diào)高速勻漿機(jī)為江蘇省金壇縣望華科教儀器廠出品,BIO RAD-680型酶標(biāo)儀由日本出品及德國Biofuge stratos型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物模型的復(fù)制 大鼠以乙醚吸入式麻醉,胸部備皮去毛消毒,圍繞正中線做荷包縫合,正中線作約2 cm長的縱向切口,鈍性分離胸大肌,暴露胸骨、肋骨,用小拉鉤將4、5肋間分開,完全暴露心臟,剝脫心包膜,以左心耳與動(dòng)脈圓錐之間的靜脈為標(biāo)志,將左冠狀動(dòng)脈前降支用縫合線結(jié)扎,心臟放回胸腔,擠出空氣,逐層關(guān)閉胸腔,縫合外皮,等待蘇醒[3]。假手術(shù)組動(dòng)物未結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支,其余手術(shù)步驟與模型組相同,其它各組與模型組手術(shù)相同。手術(shù)后連續(xù)3 d內(nèi)腹腔注射青霉素注射液。造模后第2天,選造模成功的大鼠,雌、雄各隨機(jī)分為 6組,假手術(shù)組,模型組,維生素C對(duì)照組,鹿茸多肽高、中、低劑量組各10只。

2.2 給藥 灌胃給藥21 d,給藥體積為1 mL/100 g,鹿茸多肽高、中、低劑量組劑量分別是0.016、0.008、0.004 g/kg,維生素C陽性對(duì)照組給藥劑量為0.043 g/kg,假手術(shù)組、模型組給予同體積的蒸餾水。

2.3 心肌細(xì)胞線粒體相關(guān)蛋白的提取 灌胃給藥第21 d,給藥后1 h,以20%烏來糖注射液腹腔注射麻醉,給藥劑量為1 mL/100 g。取下心臟,用生理鹽水沖洗,剔除心房及右心室,留下左心室,取心尖組織200～300 mg,生理鹽水沖洗,用濾紙吸去水分,剪碎,稱取200 mg,加4℃生理鹽水至2 mL（心肌組織含量為10%）,在冰浴4℃條件下,用高速勻漿機(jī)以1.5～1.6萬r/min勻漿,每次10 s,間隔30 s,分5次;離心（2 000 r/min,10 min,4 ℃）,取出上 清;離 心（10 000 r/min,15 min,4 ℃）,去上清,取沉淀;稱重,加4℃生理鹽水（沉淀含量為 10%）,以1.5～1.6萬r/min勻漿,每次5 s,間隔10 s,分5次,分裝備用。

2.4 Bcl-2和Bax基因表達(dá)檢測(cè) 按試劑公司提供的試劑盒操作說明操作,測(cè)定心肌細(xì)胞線粒體中凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax蛋白的含量。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)凋亡相關(guān)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,模型組的Bcl-2蛋白表達(dá)減少,Bax蛋白表達(dá)增加（P<0.05,P<0.05）,Bcl-2/Bax比值降低（P<0.01）。與模型組比較,鹿茸多肽高劑量組和鹿茸多肽中劑量,心肌細(xì)胞線粒體中Bcl-2蛋白表達(dá)增加,Bax蛋白表達(dá)減少（P<0.05,P<0.05）,Bcl-2/Bax比值高于模型組（P<0.01,P<0.01）,低劑量組與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果提示,對(duì)心肌細(xì)胞損傷時(shí)細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)有調(diào)節(jié)作用,其作用可能通過調(diào)節(jié)抗凋亡蛋白因子（Bcl-2）和促凋亡因子（Bax）的表達(dá)水平,對(duì)心肌細(xì)胞損傷起一定的保護(hù)作用。結(jié)果見表1。

表1 心肌細(xì)胞線粒體中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)（±s,n=10） ng/mL

表1 心肌細(xì)胞線粒體中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)（±s,n=10） ng/mL

注:與假手術(shù)組相比,ΔP<0.05,ΔΔP<0.01;與模型組相比,#P<0.05,##P<0.01。

組 別 Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax比值假手術(shù)組 4.15±0.69 8.62±2.28 0.49±0.12模型組 3.42±0.63Δ 10.98±1.49Δ0.33±0.12ΔΔ維生素C陽性對(duì)照組 4.15±0.63#8.58±1.49#0.50±0.12##鹿茸多肽高劑量組 4.13±0.54#8.46±1.66#0.51±0.12##鹿茸多肽中劑量組 3.99±0.40#8.72±1.78#0.47±0.07##鹿茸多肽低劑量組 3.79±0.32 9.38±1.04 0.41±0.05

4 討論

心臟活動(dòng)消耗的大量能量來自于細(xì)胞內(nèi)的線粒體的供能物質(zhì)ATP,心肌細(xì)胞缺血首先累及是線粒體,引起心肌細(xì)胞能量代謝障礙。線粒體DNA作為唯一的核外遺傳物質(zhì),在細(xì)胞能量代謝上起著重要的作用,由于缺乏組蛋白,蛋白編碼區(qū)密集無內(nèi)含子,加之與電子轉(zhuǎn)運(yùn)鏈相鄰,線粒體DNA極易受到氧化應(yīng)激的損傷,而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族在細(xì)胞凋亡過程中起著至關(guān)重要作用,Bcl-2家族基因所表達(dá)的蛋白也成為判斷細(xì)胞凋亡程度的一個(gè)檢測(cè)指標(biāo)[4],Bax是一種重要的促凋亡蛋白,而Bcl-2作為抗凋亡蛋白,二者的表達(dá)水平受到相關(guān)基因的調(diào)控。其中,抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax在細(xì)胞內(nèi)的含量,也成為判斷細(xì)胞凋亡程度的關(guān)鍵。而Bcl-2/Bax比值與細(xì)胞是否凋亡也有關(guān),比值增加細(xì)胞凋亡會(huì)受到抑制,比值降低細(xì)胞凋亡反而增多。

據(jù)研究顯示[5],鹿茸多肽對(duì)心肌缺血大鼠有緩解作用,而其機(jī)制尚未清晰。本實(shí)驗(yàn)用生化檢測(cè)法,對(duì)心肌缺血大鼠心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)的Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果顯示,模型組大鼠的Bcl-2蛋白表達(dá)下降,Bax蛋白表達(dá)上升,Bcl-2/Bax比值降低。與模型組比較,鹿茸多肽高、中劑量組心肌線粒體中Bcl-2蛋白的表達(dá)增強(qiáng),Bax蛋白的表達(dá)減少,Bcl-2/Bax比值也明顯增加,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;鹿茸多肽低劑量組Bcl-2蛋白的表達(dá)增強(qiáng),Bax蛋白的表達(dá)減少,Bcl-2/Bax比值增加,但不明顯。表明鹿茸多肽對(duì)大鼠缺血心肌損傷具有上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá),和下調(diào)Bax蛋白表達(dá)的作用,從而對(duì)心肌缺血而引起的心肌細(xì)胞凋亡有抑制作用,對(duì)于減輕心肌細(xì)胞損傷有積極的意義。

綜上所述,鹿茸多肽對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制可能與它通過抑制對(duì)線粒體中相關(guān)促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的含量調(diào)節(jié),抑制凋亡過程的啟動(dòng),從而對(duì)心肌細(xì)胞中的線粒體起保護(hù)作用,達(dá)到保護(hù)心肌細(xì)胞的目的。

[1]陳曉光,王巖等.鹿茸多肽對(duì)異丙腎上腺素誘發(fā)大鼠心肌損傷的保護(hù)作用[J].中藥藥理與臨床,2009,25（2）,64-66.

[2]謝志泉.細(xì)胞凋亡與缺血性心臟病[J].心血管病學(xué)進(jìn)展,1999,20（5）:279.

[3]施新猷.醫(yī)學(xué)動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)方法[M].北京:人民衛(wèi)生出版杜,1989:336.

[4]Cook SA,Sugden P H,Clerk A.Regulation of bcl-2 family Proteins during develoP ment and in resP onse to oxidative stress in cardiac myocytes[J].Circ Res,1999,85（10）:940-949.

[5]張永和,黃曉巍.鹿茸醇提物對(duì)心肌梗死模型大鼠心肌損傷的保護(hù)作用及對(duì)血漿內(nèi)皮素含量的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2007,14（1）:40-41.