劉立萍 任艷玲 李 然 王智民 趙金茹 蒿長英 宋 囡

(遼寧中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，遼寧 沈陽 110847)

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(PMOP)是以骨量減少、骨組織微觀結(jié)構(gòu)改變，骨脆性增強，骨折發(fā)生率高為特征的臨床常見病癥，對于PMOP的防治日益受到人們的關注，現(xiàn)代研究表明中醫(yī)藥在PMOP的藥物治療方面取得了不少成果〔1〕。左歸丸具有滋陰補腎、填精益髓作用，本課題組前期研究結(jié)果表明左歸丸對去卵巢所致PMOP大鼠有一定防治作用〔2〕。為了進一步探討左歸丸治療PMOP的作用機制，本實驗探討p38 MAPK信號通路對左歸丸含藥血清調(diào)控MC3T3-E1成骨細胞分化的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及細胞 SPF級SD雌性大鼠60只，(200±20)g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，許可證號:SCXK(滬)2008-0016。MC3T3-E1 Subclone 14，由中國科學院上海生命科學研究院提供。MC3T3-E1成骨細胞用含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，每周換2次培養(yǎng)液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。

1.2 藥物與試劑 左歸丸(上海雷允上封浜制藥有限公司，國藥準字Z31020371);倍美力結(jié)合雌激素片(愛爾蘭惠氏藥廠，國藥準字 J20050120)，SB203580、PNPP、茜素紅(Sigma)，抗ALP抗體(博士德)，抗GAPDH抗體(北京中杉)。

1.3 主要儀器 iMark型酶標儀(Bio-Rad);Trans-Blot SD半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(Bio-Rad);EC3凝膠成像儀(UVP)。

1.4 方法

1.4.1 含藥血清的制備 大鼠按體重隨機分為3組，空白對照組、左歸丸組、倍美力組，20只/組。根據(jù)人與大鼠等劑量換算公式折算大鼠左歸丸的等臨床劑量為1.6 g/kg體重，倍美力為56.25 μg/kg。藥物灌服10 ml/kg，空白對照組灌服蒸餾水，2次/d，于第8天給藥2 h后，麻醉，腹主動脈取血，室溫靜置2 h，離心20 min，取血清，56 ℃滅活30 min，過濾除菌，－80 ℃保存。

1.4.2 細胞實驗分組 p38 MAPK特異阻滯劑SB203580(10 μmol/L)用DMSO(濃度＜0.1%)溶解。實驗分為空白對照組(Control)、SB203580組(SB)、左歸丸組(ZG)、左歸丸加SB203580組(ZG+SB)、倍美力組(BML)、倍美力加SB203580組(BML+SB)。

1.4.3 堿性磷酸酶活性測定 以1×105接種于48孔培養(yǎng)板，24 h后，換用含0.2%FBS的α-MEM培養(yǎng)液饑餓24 h，棄培養(yǎng)液，加入不含或含10 μmol/L SB203580的α-MEM培養(yǎng)液，170 μl/孔，預處理 60 min。各組加入相應的含藥血清，30 μl/孔，孵育48 h。0.1%Triton X-100裂解液，4℃作用過夜，轉(zhuǎn)入－20℃，室溫解凍，反復凍融3次，冰水浴內(nèi)超聲，收集裂解液，BCA法測定蛋白濃度。采用PNPP法測定裂解產(chǎn)物中的堿性磷酸酶活性，測定孔內(nèi)加入基質(zhì)溶液，100 μl/孔，充分混勻37℃孵育15 min，加入0.5 mol/L NaOH 終止反應，80 μl/孔，混勻，酶標儀上415 nm測定光密度值。

1.4.4 改良鈣鈷法染色 以1×105接種于24孔板，融合達80%，換用含0.2%FBS的α-MEM培養(yǎng)液饑餓24 h，棄培養(yǎng)液，加入不含或含10 μmol/L SB203580的 α-MEM培養(yǎng)液，340 μl/孔，預處理60 min。各組加入相應的含藥血清，60 μl/孔，孵育7 d，每3 d換1次液。95%酒精固定10 min，PBS洗，加入孵育液，37℃ 孵育4 h，去離子水沖洗，2%硝酸鈷溶液5 min，去離子水沖洗，1%硫化銨溶液1 min，去離子水沖洗。

1.4.5 礦化作用分析 孵育14 d，余同1.4.4。95%酒精固定10 min，PBS洗，0.1%茜素紅-Tris-Hcl(pH8.3)37℃，避光孵育30 min，去離子水沖洗。

1.4.6 Western印跡分析 以2×106接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，融合達80%，換用含0.2%FBS的α-MEM培養(yǎng)液饑餓24 h，換用不含或含10 μmol/L SB203580的 α-MEM 培養(yǎng)液5.1 ml，預孵育60 min后，各組加入相應的含藥血清，0.9 ml/瓶，孵育48 h。提取總蛋白，BCA測定蛋白濃度，提取液中加入5×SDS上樣緩沖液，100℃變性5 min，上樣每孔含60 μg蛋白，12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜3 h，5%脫脂奶粉37℃封閉1 h。一抗4℃孵育過夜，二抗山羊抗兔HRP 37℃孵育2 h，ECL發(fā)光。實驗結(jié)果采用Quantity one軟件分析，掃描光密度值。采用所測ALP蛋白條帶與內(nèi)參GAPDH條帶的光密度比值來表示ALP蛋白的表達水平。

1.5 統(tǒng)計學分析 計量數(shù)據(jù)采用SPSS10.0軟件處理，用One-Way ANOVA進行分析，數(shù)據(jù)以±s表示。

2 結(jié)果

2.1 p38阻滯劑對左歸丸含藥血清干預MC3T3成骨細胞ALP活性和礦化作用的影響 與Control組比較，ZG組和BML組顯著增強MC3T3-E1成骨細胞ALP活性和礦化作用(P＜0.01);與ZG組比較，ZG+SB組明顯抑制左歸丸含藥血清對MC3T3-E1成骨細胞ALP活性和礦化沉積的誘導作用(P＜0.01)，且ZG組優(yōu)于BML組(P＜0.05);與BML組比較，BML+SB組顯著抑制倍美力含藥血清誘導的MC3T3-E1成骨細胞的ALP活性和礦化沉積(P＜0.01)。見表1。

2.2 p38抑制劑對左歸丸含藥血清干預MC3T3-E1成骨細胞ALP蛋白表達的影響 與Control組(1)比較，ZG組和BML組均促進MC3T3-E1成骨細胞ALP蛋白的表達(2.395±0.072，1.938±0.023，P＜0.01);與ZG組比較，ZG+SB組顯著對抗左歸丸含藥血清誘導MC3T3-E1成骨細胞ALP蛋白的高表達(1.233±0.058，P＜0.01)，ZG 組優(yōu)于 BML組(P＜0.01);與BML組比較，BML+SB組顯著下調(diào) ALP蛋白表達水平(1.090±0.035，P＜0.01)。SB組 ALP蛋白表達為1.003±0.066。見圖1。

表1 p38 MAPK通路對左歸丸含藥血清干預MC3T3-E1細胞ALP活性和礦化作用的影響(±s)

表1 p38 MAPK通路對左歸丸含藥血清干預MC3T3-E1細胞ALP活性和礦化作用的影響(±s)

與Control組比較:1)P＜0.01;與 ZG組比較:2)P＜0.05，3)P＜0.01;與BML組比較:4)P＜0.01

組別ALP活性(n=5，nmol·min －1·mg－1)ALP活性(n=3，%)礦化作用(n=3，%)Control 0.247±0.018 1 1 SB 0.185±0.0121) 0.444±0.0731) 0.492±0.0521)ZG 0.477±0.0191) 2.930±0.1241) 3.957±0.0621)ZG+SB 0.355±0.0181)3) 1.717±0.1481)3) 1.050±0.0663)BML 0.381±0.0201)3) 2.763±0.0561)2) 2.967±0.0681)3)BML+SB 0.286±0.0121)4) 1.629±0.0731)4) 1.099±0.0734)

圖1 p38抑制劑對左歸丸含藥血清干預MC3T3-E1成骨細胞ALP蛋白表達的影響(± s，n=3)

3 討論

PMOP屬于中醫(yī)“骨痿”、“骨痹”范疇，絕經(jīng)后婦女腎氣衰，天癸竭，骨失所養(yǎng)，臨床治療以中醫(yī)“腎主骨”為基本指導理論，以補腎法為主要治療法則，選用補腎方藥防治PMOP。左歸丸作為具有補腎作用的代表方劑，能夠有效防治PMOP〔2～4〕。

成骨細胞分化參與骨形成，包括Ⅰ型膠原積累，ALP和骨鈣素表達，礦化作用形成礦化結(jié)節(jié)。成骨細胞增殖受抑制及其分化程度降低，將直接導致骨形成減少，引發(fā)骨質(zhì)疏松〔5〕，刺激成骨細胞增殖并促進其分化成熟是防治骨質(zhì)疏松的主要方法〔6〕。本實驗結(jié)果表明左歸丸含藥血清能夠增強MC3T3-E1成骨細胞ALP活性和礦化作用，上調(diào)ALP蛋白的表達水平，促進MC3T3-E1成骨細胞分化，參與骨形成，從而有效防治PMOP。

p38 MAPK是促分裂原活化蛋白激酶的亞科，在成骨細胞分化中起著重要作用〔7〕，抗骨質(zhì)疏松藥增強MC3T3-E1成骨細胞的分化和礦化作用〔8〕，甲狀旁腺激素能夠通過p38 MAPK通路促進成骨細胞骨形成〔9〕，SB203580阻滯p38主要與減少ALP活性相關〔10〕。本研究結(jié)果表明SB203580阻滯p38 MAPK通路減少ALP活性和礦化作用，下調(diào)ALP蛋白的表達水平，抑制左歸丸含藥血清對MC3T3-E1成骨細胞分化的促進作用，提示左歸丸含藥血清可能部分通過p38 MAPK通路影響MC3T3-E1成骨細胞分化，促進骨生成，這可能是左歸丸有效防治PMOP的作用機制之一。對于左歸丸含藥血清是否依賴ERK和JNK通路影響成骨細胞分化，不同MAPK通路對左歸丸含藥血清促進成骨細胞分化作用的影響是否相同值得我們進一步研究。

1 劉建寧，王 曄.中醫(yī)藥治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥概況〔J〕.中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2011;(4):465-6.

2 呂海波，任艷玲，王 瑩，等.左歸丸防治去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥的實驗研究〔J〕.中國骨質(zhì)疏松雜志，2010;16(11):847-50.

3 鞠大宏，劉梅潔，趙宏艷，等.左歸丸含藥血清對成骨細胞OPG、RANKL mRNA表達的影響〔J〕.北京中醫(yī)藥大學學報，2008;31(5):312-5.

4 劉梅潔，潘靜華，李 艷，等.左歸丸對糖皮質(zhì)激素所致骨質(zhì)疏松大鼠血清中BGP，IGF-Ⅰ含量的影響〔J〕.中國實驗方劑學雜志，2011;17(16):133-6.

5 杜 波，王 婧.菟絲子含藥血清對成骨細胞代謝調(diào)控的影響〔J〕.中醫(yī)雜志，2011;52(22):1951-3.

6 明磊國，陳克明，葛寶豐，等.淫羊藿苷與染料木黃酮對體外培養(yǎng)成骨細胞增殖及礦化成熟影響的對比研究〔J〕.中國中藥雜志，2011;36(16):2240-5.

7 Yuanyu Hu，Emily Chan，Sherryx Wang，et al.Activation of p38 mitogenactivated protein kinase is required for osteoblast differentiation〔J〕.Endocrinology，2003;144(5):2068-74.

8 Kim DY，Jung MS，Park YG，et al.Ginsenoside Rh2(S)induces the differentiation and mineralization of osteoblastic MC3T3-E1 cells through activation of PKD and p38 MAPK pathways〔J〕.BMB Reports，2011;44(10):659-64.

9 Rey A，Manen D，Rizzoli R，et al.Evidences for a role of p38 MAP kinase in the stimulation of alkaline phosphatase and matrix mineralization induced by parathyroid hormone in osteoblastic cells〔J〕.Bone，2007;41(1):59-67.

10 Guicheux J，Lemonnier J，Ghayor C，et al.Activation of p38 mitogen-activated protein kinase and c-Jun-NH2-terminal kinase by BMP-2 and their implication in the stimulation of osteoblastic cell differentiation〔J〕.Bone Miner Res，2003;18(11):2060-8.