黃 俊 黃江燕 吳鈞芳 姜 紅 萬(wàn) 歡 張明霞 (南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，江西 南昌 330006)

血管內(nèi)皮的損傷是動(dòng)脈增生性疾病和后續(xù)并發(fā)癥的始動(dòng)因素，內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)能分化為成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞，在維持內(nèi)皮功能穩(wěn)定、促進(jìn)血管修復(fù)方面有重要作用。高血壓患者外周血中EPCs數(shù)量減少、功能受損，與血管內(nèi)皮功能障礙密切相關(guān)。硝苯地平、塞利洛爾、洛沙坦等藥物在降壓治療的同時(shí)，能增加患者外周血中EPCs數(shù)量，并改善其遷移、分化、抗氧化功能，從而改善血管內(nèi)皮功能〔1，2〕。本文旨在研究血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑貝那普利對(duì)高血壓患者外周血中EPCs功能的影響及初步機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 患者入選 連續(xù)入選新診斷的1級(jí)原發(fā)性高血壓患者58例，平均年齡(46±13)歲，男39例，女19例。診斷標(biāo)準(zhǔn)按《中國(guó)高血壓防治指南2009年版》〔3〕，血壓檢測(cè)以24 h動(dòng)態(tài)血壓檢測(cè)為準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn):既往已服用過(guò)降壓藥物、合并血脂、血糖代謝異常、抽煙、酗酒、合并感染性疾病、高熱、應(yīng)用炎癥抑制藥物者。擲硬幣法隨機(jī)分為治療組30例，平均年齡(46±11)歲，男21例，女9例，貝那普利10 mg/d(北京諾華公司)和對(duì)照組28例，平均年齡(45±14)歲，男20例，女8例，暫不行藥物治療，健康組30例為年齡、性別與研究組相匹配的健康體檢者，研究時(shí)間4 w。分別于研究前后清晨空腹采血。

1.2 內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定及功能檢測(cè)

1.2.1 內(nèi)皮祖細(xì)胞的采集、分離、培養(yǎng)、鑒定 每例患者取外周血15 ml，常規(guī)密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞。以1×105/孔的密度接種在人纖維連接蛋白包被的6孔培養(yǎng)板，EGM-2-MV培養(yǎng)基及5%細(xì)胞來(lái)源患者血清于5%CO2培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)4 d，PBS洗掉非貼壁細(xì)胞。為維持細(xì)胞原生存環(huán)境，EGM-2-MV培養(yǎng)基加20%的細(xì)胞來(lái)源患者血清，繼續(xù)培養(yǎng)至7 d后進(jìn)行各種檢查分析。貼壁細(xì)胞用Dil-acL、FITC-UEA-I行熒光化學(xué)染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察，雙染色細(xì)胞被認(rèn)為是正在分化的EPCs。每孔隨機(jī)選擇10個(gè)視野EPCs計(jì)數(shù)，取其平均值換算細(xì)胞濃度。實(shí)驗(yàn)分為健康組、對(duì)照組、貝那普利治療組。

1.2.2 貝那普利治療前后對(duì)EPCs增殖能力的影響 96孔培養(yǎng)板每孔接種5×103個(gè)EPCs，培養(yǎng)24 h待其貼壁后，以PBS洗滌2次，再用含1%細(xì)胞來(lái)源患者血清的EGM-2-MV培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h后開始實(shí)驗(yàn)，用含20%患者血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，每孔加入MTT至終濃度為500 mg/L，繼續(xù)培養(yǎng)5 h棄培養(yǎng)液，加入 DMSO 150 μl，振蕩使結(jié)晶溶解后酶標(biāo)儀讀取A490 nm值。

1.2.3 貝那普利治療前后對(duì)EPCs遷移能力的影響 用含1%細(xì)胞來(lái)源患者血清的EGM-2-MV培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后開始實(shí)驗(yàn)。將含20%患者血清培養(yǎng)液30 μl注入改良的Boyden下室，將含3×104個(gè)EPCs的培養(yǎng)液50 μl注入上室，刮去濾膜上面的未移動(dòng)細(xì)胞甲醇固定，Giemsa染色，隨機(jī)選擇5個(gè)顯微鏡視野(×200)計(jì)數(shù)遷移到下室的細(xì)胞。

1.2.4 貝那普利治療前后對(duì)EPCs黏附能力的影響 用含20 mg/L人纖維連接蛋白的 PBS包被 96孔板，50 μl/well，4℃過(guò)夜備用。用含1%細(xì)胞來(lái)源患者血清的EGM-2-MV培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h后開始實(shí)驗(yàn)。用含20%患者血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，調(diào)細(xì)胞濃度為1×108/L，100 μl/well加入包被好的96孔板中。37℃、5%CO2下黏附45 min，PBS洗去未黏附的細(xì)胞。每孔加入CCK-8溶液10 μl，4 h后比較各組吸光度值。

1.3 貝那普利治療前后，EPCs氧化應(yīng)激檢測(cè) 用1%細(xì)胞來(lái)源患者血清的EGM-2-MV培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h后開始實(shí)驗(yàn)。用含20%患者血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，黃嘌呤氧化法測(cè)定上清液中超氧化物歧化酶(SOD)活力，硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛(MDA)含量。按照試劑盒說(shuō)明書操作，分光光度儀(日本Hitachi公司)測(cè)取各組的吸光度OD值，計(jì)算各組的SOD活性、MDA含量。

1.4 超聲檢測(cè)血管內(nèi)皮功能 參照Celermajer等〔4〕方法，受試者仰臥位休息10 min，左臂肘關(guān)節(jié)上方2～10 cm處探查肱動(dòng)脈長(zhǎng)軸切面，心室舒張期末測(cè)量肱動(dòng)脈前后內(nèi)膜之間的距離，即基礎(chǔ)肱動(dòng)脈內(nèi)徑。然后行反應(yīng)性充血試驗(yàn)，血壓計(jì)袖帶將前臂加壓至300 mmHg持續(xù)5 min，然后迅速放氣，1 min內(nèi)再次記錄及測(cè)量肱動(dòng)脈內(nèi)徑。測(cè)試過(guò)程中探頭始終處于固定位置，每次測(cè)量肱動(dòng)脈內(nèi)徑均取同一部位。血流介導(dǎo)的血管擴(kuò)張(FMD)=(充血后肱動(dòng)脈內(nèi)徑-基礎(chǔ)狀態(tài)肱動(dòng)脈內(nèi)徑)/基礎(chǔ)狀態(tài)肱動(dòng)脈內(nèi)徑×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，多組均數(shù)間比較進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)和單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 貝那普利治療前后患者血壓、心率、血管內(nèi)皮依賴性擴(kuò)張反應(yīng)變化 高血壓患者經(jīng)貝那普利10 mg/d治療4 w，其收縮壓、舒張壓與治療前比較均明顯降低(P＜0.05)，而貝那普利治療前的血壓與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異。心率各組之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。血流介導(dǎo)的肱動(dòng)脈血管擴(kuò)張F(tuán)MD值貝那普利組治療前與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異，而貝那普利治療后與治療前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 入選各組患者經(jīng)貝那普利治療前后的血壓、心率、血管內(nèi)皮依賴性擴(kuò)張反應(yīng)變化(±s)

與治療前比較:1)P＜0.05，下表同

組別 n 收縮壓(mmHg)舒張壓(mmHg)心率(次/min)動(dòng)脈內(nèi)徑(mm)FMD(%)健康組30 116±16 68±11 68±21 3.72±0.61 16.7±7.2對(duì)照組 28 142±19 91±11 64±18 3.76±0.68 6.6±4.3貝那普利治療前 30 143±18 92±9 66±19 3.78±0.69 6.8±4.4貝那普利治療后 30 121±141)72±111) 67±16 3.81±0.72 12.2±5.21)

2.2 貝那普利治療前后患者外周血EPCs增殖、遷移、黏附能力變化 入選患者經(jīng)貝那普利10 mg/d治療4 w前后分別采外周血分離培養(yǎng)EPCs檢測(cè)。對(duì)照組與貝那普利治療前患者比較，其EPCs的增殖、遷移、黏附能力無(wú)明顯差異，而貝那普利治療后與治療前比較，EPCs的增殖、遷移、黏附能力明顯改善(P＜0.05)。見表2。

表2 入選各組患者貝那普利治療前后EPCs的增殖、遷移、黏附能力(±s)

表2 入選各組患者貝那普利治療前后EPCs的增殖、遷移、黏附能力(±s)

組別 n 增殖(A490 nm)遷移細(xì)胞(×102)黏附細(xì)胞(×102)健康組30 0.523±0.068 13.8±2.9 38.1±5.3對(duì)照組 28 0.245±0.032 7.2±1.1 19.6±2.4貝那普利治療前 30 0.238±0.033 7.4±1.2 18.9±2.5貝那普利治療后 30 0.495±0.0581) 12.6±2.31) 32.8±4.91)

2.3 貝那普利治療前后患者外周血EPCs中SOD、MDA變化入選患者經(jīng)貝那普利10 mg/d治療4 w前后分別采外周血分離培養(yǎng)EPCs檢測(cè)SOD、MDA水平。對(duì)照組與貝那普利治療前患者比較EPCs中SOD活性、MDA含量無(wú)明顯差異，而貝那普利治療后與治療前比較，EPCs中的SOD活性、MDA含量明顯改善(P＜0.05)。見表3。

表3 入選各組患者貝那普利治療前后EPCs的SOD、MDA檢測(cè)(±s)

表3 入選各組患者貝那普利治療前后EPCs的SOD、MDA檢測(cè)(±s)

組別 n SOD(U/ml) MDA(nmol/ml)健康組30 75.54±8.96 9.36±1.64對(duì)照組 28 40.63±9.87 16.15±2.43貝那普利治療前 30 41.26±10.15 15.87±2.71貝那普利治療后 30 69.89±10.541) 10.21±1.781)

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷既是心、腦、腎等器官病變及各種血管病變的始動(dòng)因素，也是許多心腦血管疾病危險(xiǎn)因子作用的靶器官。Asahara等〔5〕首次報(bào)道外周血中可分離出EPCs，EPCs能增殖分化為成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞，參與出生后的血管新生、血管形成及內(nèi)皮損傷修復(fù)，在保護(hù)中發(fā)揮一定作用。

由于外周血中EPCs獨(dú)特的血管內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)功能，高血壓患者外周血中EPCs的功能研究日益受到關(guān)注。Oliveras等〔6〕研究證實(shí)難治性高血壓患者外周血中EPCs的數(shù)量明顯減少，同時(shí)內(nèi)皮依賴性血管擴(kuò)張反應(yīng)受損。Sugiura等〔1〕用nifedipine治療高血壓患者4 w，發(fā)現(xiàn)患者內(nèi)皮依賴性血管擴(kuò)張反應(yīng)改善，外周血中EPCs數(shù)量增加，體外培養(yǎng)的EPCs遷移、分化、抗氧化功能增強(qiáng)。高血壓的發(fā)病機(jī)制中腎素-血管緊張素系統(tǒng)起重要作用，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑貝那普利在降低血壓的同時(shí)，改善血管、心臟重構(gòu)，改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能。本研究進(jìn)一步證實(shí)貝那普利能改善1級(jí)高血壓患者外周血中EPCs的增殖、遷移、黏附能力，從而增加修復(fù)受損血管內(nèi)皮細(xì)胞的能力，改善患者血管內(nèi)皮功能。

機(jī)體正常情況下活性氧產(chǎn)生和抗氧化酶保持一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA的醛基可與血管內(nèi)皮細(xì)胞生物膜磷脂中的磷脂酰膽堿和磷脂酰絲氨酸的氨基組分發(fā)生交聯(lián)聚合反應(yīng)，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞退行性變化和通透性改變?？寡趸窼OD可抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，在維持體內(nèi)氧自由基的動(dòng)態(tài)平衡方面有重要意義。高血壓患者EPCs功能受損與氧化應(yīng)激有密切關(guān)系，抗氧化劑塞利洛爾治療高鹽飲食自發(fā)性高血壓大鼠2 w，EPCs數(shù)量、體外遷移黏附能力明顯提高，EPCs衰老減少，氧化應(yīng)激產(chǎn)物減少〔7〕。ARB類藥物洛沙坦改善自發(fā)性高血壓大鼠的EPCs功能與其抗氧化應(yīng)激有關(guān)〔2〕，替米沙坦通過(guò)調(diào)節(jié)高糖環(huán)境下血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)來(lái)保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能〔8〕。對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)由本觀察也可以看出，貝那普利在降壓的同時(shí)也改善了1級(jí)高血壓患者外周血中EPCs氧化應(yīng)激反應(yīng)。血管內(nèi)皮功能障礙的臨床客觀證據(jù)是內(nèi)皮依賴性舒張功能下降，高分辨超聲能顯示肱動(dòng)脈的清晰圖像，是無(wú)創(chuàng)檢測(cè)血管內(nèi)皮依賴性舒張功能簡(jiǎn)單而可靠的方法。本研究證實(shí)貝那普利治療4 w明顯改善了1級(jí)高血壓患者的血管內(nèi)皮舒張功能。

綜上，1級(jí)高血壓患者采用貝那普利治療4 w能明顯降低血壓，改善患者的血管內(nèi)皮功能。而這些作用除與阻斷腎素-血管緊張素系統(tǒng)機(jī)制外，對(duì)患者外周血中EPCs功能的改善、氧化應(yīng)激反應(yīng)的抑制也有一定的關(guān)系。

1 Sugiura T，Kondo T，Kureishi-Bando Y，et al.Nifedipine improves endothelial function:role of endothelial progenitor cells〔J〕.Hypertension，2008;52(3):491-8.

2 Yao EH，F(xiàn)ukuda N，Matsumoto T，et al.Losartan improves the impaired function of endothelial progenitor cells in hypertension via an antioxidant effec〔tJ〕.Hypertens Res，2007;30(11):1119-28.

3 劉力生，王 文，姚崇華.中國(guó)高血壓防治指南(2009年基層版)〔J〕.中華高血壓雜志，2010;18(1):11-30.

4 Celermajer DS，Soreasen KE，Gooch V，et al.Non-invasive detection of endothelial dysfunction in children and adults at risk of atherosclerosis〔J〕.Lancet，1992;340(8828):1111-5.

5 Asahara T，Murohara T，Sullivan A，et al.Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis〔J〕.Science，1997;275(5320):964-7.

6 Oliveras A，de la Sierra A，Martínez-Estrada OM，et al.Putative endothelial progenitor cells are associated with flow-mediated dilation in refractory hypertensives〔J〕.Blood Press，2008;17(5-6):298-305.

7 Yao EH，F(xiàn)ukuda N，Matsumoto T，et al.Effects of the antioxidative betablocker celiprolol on endothelial progenitor cells in hypertensive rats〔J〕.Am J Hypertens，2008;21(9):1062-8.

8 黃 俊，肖 靜，赫連蔓，等.替米沙坦對(duì)高糖環(huán)境下人血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制的研究〔J〕.中華高血壓雜志，2008;16(4):314-6.