王美琴，盧海波，趙立娟，郝曉娟

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801；2.祁縣峪口鄉(xiāng)人民政府，山西祁縣030900）

隨著社會(huì)生產(chǎn)力的發(fā)展，人們對(duì)生活環(huán)境質(zhì)量愈來(lái)愈關(guān)注，對(duì)綠色食品的要求亦愈迫切，這就不可避免地要求限制化學(xué)農(nóng)藥的使用量及應(yīng)用范圍。近年來(lái)，應(yīng)用微生物代替（或部分代替）化肥和農(nóng)藥，越來(lái)越受到各國(guó)政府及學(xué)者的高度重視[1]。植物內(nèi)生菌與寄主植物在長(zhǎng)期共同進(jìn)化過(guò)程中形成了密切的相互關(guān)系，且生存微環(huán)境穩(wěn)定，成為化肥、農(nóng)藥和其他微生態(tài)制劑的最佳競(jìng)爭(zhēng)者，其合理應(yīng)用將減少化學(xué)農(nóng)藥造成的環(huán)境污染、提高農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的生物多樣性和有利于保持生態(tài)平衡[2-4]。據(jù)報(bào)道，植物內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物中具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的物質(zhì)如植物生長(zhǎng)素、乙烯、赤霉素和細(xì)胞分裂素等，可直接促進(jìn)植物生長(zhǎng)。Sturz等[5]對(duì)從馬鈴薯和紅三葉草中分離的內(nèi)生細(xì)菌研究發(fā)現(xiàn)，有21%對(duì)寄主生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，13%對(duì)寄主生長(zhǎng)表現(xiàn)為抑制作用。Tien等[6]就內(nèi)生細(xì)菌對(duì)植物促生作用的機(jī)制進(jìn)行研究，結(jié)果表明，內(nèi)生細(xì)菌可以通過(guò)生物固氮或產(chǎn)生植物激素直接促進(jìn)植物生長(zhǎng)；Lazarovits等[7]證明，內(nèi)生細(xì)菌可以通過(guò)誘導(dǎo)寄主植物產(chǎn)生植物激素；何紅等[8]在研究?jī)?nèi)生枯草芽孢桿菌BS-1，BS-2菌株對(duì)辣椒和白菜促生作用機(jī)制中也發(fā)現(xiàn)，用菌株培養(yǎng)液浸種后，導(dǎo)致植株體內(nèi)生長(zhǎng)素（IAA）、赤霉素（ GA3）和玉米素（ ZR4）等植物內(nèi)源激素含量增加，脫落酸（ABA）含量下降。Xu等[9-10]研究表明，內(nèi)生細(xì)菌還可以通過(guò)改變寄主植物對(duì)霜凍等有害環(huán)境條件及有害病原生物的敏感性或防止植物病害的發(fā)生等促進(jìn)植物生長(zhǎng)。

為了研究山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病害生防作用課題組分離篩選出的對(duì)核桃腐爛病菌具有拮抗作用的內(nèi)生菌株HT3是否具有促生功能，本試驗(yàn)研究了該菌株代謝產(chǎn)物對(duì)番茄、黃瓜種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

細(xì)菌培養(yǎng)用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA），即蛋白胨7.5 g，牛肉浸膏3.0 g，葡萄糖2.5 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水 1 000 mL，pH值7.0～7.2。 不加瓊脂為液體培養(yǎng)液（NB）。

內(nèi)生菌HT3是由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室從健康的核桃枝條中分離篩選出的拮抗菌株。供試作物種子為番茄（海紅一號(hào)）和黃瓜（津研四號(hào)）。

1.2 內(nèi)生菌HT3培養(yǎng)濾液的制備

核桃內(nèi)生菌HT3在NA斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后，取兩環(huán)接種于裝液量為100 mL、體積為250 mL的錐形瓶，置于28℃，160 r/min，振蕩培養(yǎng)48 h即為菌株培養(yǎng)液，再置于18 000 r/min的離心機(jī)上離心15 min，其上清液用直徑0.45μm過(guò)濾膜過(guò)濾后，過(guò)濾液在4℃的條件下進(jìn)行保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 內(nèi)生菌株HT3培養(yǎng)濾液對(duì)番茄、黃瓜種子萌發(fā)的影響

將1.2制備的培養(yǎng)濾液原液用無(wú)菌水分別稀釋為 1.25，2，5，10，20，100倍。 將黃瓜、番茄種子分別浸泡在不同倍數(shù)的稀釋濾液中12，24 h后，放在鋪有濾紙的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，每皿放20粒種子，每個(gè)處理3次重復(fù)，在25℃的恒溫箱中培養(yǎng)，每天按時(shí)用無(wú)菌水補(bǔ)足水分以保持濾紙潮濕。3 d后觀察和記錄種子的發(fā)芽率以及胚芽生長(zhǎng)量。以空白培養(yǎng)液的離心上清液作為對(duì)照[11-12]。

1.4 內(nèi)生菌株HT3培養(yǎng)濾液對(duì)黃瓜、番茄幼苗生長(zhǎng)的影響

分別用稀釋10倍的HT3培養(yǎng)濾液、NB培養(yǎng)液和無(wú)菌水浸泡黃瓜和番茄種子12 h，然后播種于無(wú)菌土花盆中，每盆播種15粒，每處理重復(fù)3次，置于人工氣候箱中培養(yǎng)（白天25℃，晚上20℃），出苗后調(diào)查出苗率。每盆選大小一致的10株苗（其余的剔除），于播種后20 d分別測(cè)定其株高、莖粗、根長(zhǎng)及植株的鮮質(zhì)量，植株干質(zhì)量于80℃烘干3 h后稱量[13-14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生菌HT3培養(yǎng)濾液對(duì)番茄、黃瓜種子發(fā)芽率的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，種子的發(fā)芽率與培養(yǎng)濾液的稀釋倍數(shù)、浸泡時(shí)間沒(méi)有相關(guān)性，在所測(cè)試的稀釋倍數(shù)范圍內(nèi)，種子的萌發(fā)率與對(duì)照相比，差異不顯著。

2.2 內(nèi)生菌HT3培養(yǎng)濾液對(duì)番茄、黃瓜種子胚芽生長(zhǎng)量的影響

由圖1可知，用不同稀釋倍數(shù)的菌株HT3培養(yǎng)濾液處理的番茄、黃瓜種子都能夠正常發(fā)芽生長(zhǎng)，但不同稀釋倍數(shù)對(duì)胚芽的生長(zhǎng)量影響不同。HT3培養(yǎng)濾液在稀釋5～100倍之間對(duì)番茄、黃瓜種子的萌發(fā)具有明顯地促生作用，在這一稀釋倍數(shù)范圍內(nèi)胚芽的生長(zhǎng)量明顯大于對(duì)照，當(dāng)培養(yǎng)濾液稀釋10倍時(shí)，番茄和黃瓜種子胚芽的生長(zhǎng)量分別為對(duì)照的215%和142%；當(dāng)稀釋倍數(shù)小于5倍時(shí)，對(duì)胚芽的生長(zhǎng)出現(xiàn)了抑制作用，并隨著稀釋倍數(shù)的降低抑制作用愈來(lái)愈強(qiáng)。當(dāng)稀釋1.25倍時(shí)，種子不萌發(fā)。

2.3 番茄種子在內(nèi)生菌HT3培養(yǎng)濾液中浸泡不同時(shí)間后胚芽和胚根的生長(zhǎng)量

從圖2可以看出，內(nèi)生菌HT3稀釋10倍的培養(yǎng)濾液浸泡番茄種子后，胚根和胚芽的生長(zhǎng)量均顯著大于對(duì)照，種子浸泡12 h后，無(wú)論是胚芽的生長(zhǎng)量還是胚根的生長(zhǎng)量都明顯高于浸泡24 h。12 h處理的種子胚芽長(zhǎng)度為31.5 mm，24 h處理的種子胚芽長(zhǎng)度為29.3 mm。

2.4 內(nèi)生菌HT3培養(yǎng)濾液對(duì)番茄和黃瓜種子幼苗的促生作用

從表1可以看出，稀釋10倍的HT3培養(yǎng)濾液浸種處理對(duì)幼苗生長(zhǎng)有明顯的促生作用，與對(duì)照相比差異顯著，增加了番茄和黃瓜幼苗的平均鮮質(zhì)量和干質(zhì)量，且與對(duì)照相比，增加均達(dá)到130%以上；番茄和黃瓜幼苗的平均株高與對(duì)照相比，分別增加31.66%和68.02%，平均莖粗與對(duì)照相比，分別增加86.54%和69.35%。結(jié)果還表明，空白NB培養(yǎng)液浸種對(duì)番茄和黃瓜幼苗的生長(zhǎng)雖然與菌株培養(yǎng)濾液相比差距大，但與無(wú)菌水相比均有不同程度的促進(jìn)作用，可見(jiàn)空白NB培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)成分也可促進(jìn)種子的萌發(fā)。

表1 內(nèi)生菌HT3培養(yǎng)濾液對(duì)番茄和黃瓜幼苗的促生作用

3 結(jié)論與討論

關(guān)于植物內(nèi)生菌的促生作用國(guó)內(nèi)已有許多相關(guān)的報(bào)道，涉及的植物有農(nóng)作物、蔬菜及水果等各個(gè)領(lǐng)域[11-16]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，核桃內(nèi)生菌HT3菌株對(duì)番茄和黃瓜種子的萌發(fā)和幼苗的生長(zhǎng)都具有明顯促生作用。菌株培養(yǎng)濾液處理的番茄和黃瓜植株苗比清水處理的健壯、葉片大、葉色濃綠、莖稈粗、根毛長(zhǎng)。菌液處理的種子萌發(fā)后胚芽和胚根的生長(zhǎng)量都明顯高于對(duì)照，但不同稀釋倍數(shù)的菌株培養(yǎng)濾液對(duì)種子的促生作用是不同的。當(dāng)稀釋倍數(shù)太低時(shí)反而對(duì)種子萌發(fā)有抑制現(xiàn)象，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是由于內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物——生長(zhǎng)激素類物質(zhì)高造成的。所以，在利用內(nèi)生菌作為生物肥料時(shí)，應(yīng)將內(nèi)生細(xì)菌的有效含量控制在一定范圍內(nèi)。同時(shí)結(jié)果顯示，內(nèi)生菌的培養(yǎng)液對(duì)種子浸泡12 h后的促生作用更好。種子的發(fā)芽率與是否經(jīng)過(guò)培養(yǎng)液的處理之間沒(méi)有相關(guān)性，本試驗(yàn)中所使用的內(nèi)生菌在稀釋倍數(shù)大時(shí)，對(duì)番茄和黃瓜種子沒(méi)有明顯的毒害作用。關(guān)于菌株HT3的生防作用方面還未見(jiàn)報(bào)道，山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院核桃內(nèi)生菌對(duì)植物病害生防作用課題組前期研究表明，該菌株對(duì)多種病原菌具有抑制作用，有關(guān)該菌株的其他方面如生物活性物質(zhì)的主要成分及分子結(jié)構(gòu)、在田間的生防作用及促生功能受環(huán)境因素的影響等還有待于研究。本研究為具有防病、促生、固氮等多功能菌株的開(kāi)發(fā)應(yīng)用和植物病害的生物防治提供了有用的資源。

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