董長(zhǎng)征 李文玲 董秀芳 岳向勇 康進(jìn)生 王蘊(yùn)欣 孔艷麗 趙文清(河北省人民醫(yī)院，河北 石家莊 05005)

最近幾年臨床上應(yīng)用低劑量伽瑪?shù)墩丈渲委煿δ軈^(qū)癲癇取得一定療效〔1〕，但其治療效果及作用機(jī)制仍在探索研究之中〔2〕。因此，能否制作一種適合予伽瑪?shù)墩丈溲芯康膶?shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，成為伽瑪?shù)堆芯康闹匾疤釛l件。本實(shí)驗(yàn)觀察青霉素建立確切、穩(wěn)定功能區(qū)癲癇模型的可行性并初步探討伽瑪?shù)墩丈渲委煱d癇的可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑及儀器 健康雄性成年貓18只，體重2.5～3.5 kg，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。注射用青霉素(華北制藥股份有限公司，批號(hào)13020655);異丙酚(200 mg/支，北京費(fèi)森尤斯公司);721型分光光度計(jì)(山東高密彩虹分析儀器有限公司)。核磁共振儀(Signa 1.5T，美國(guó)GE公司);伽瑪?shù)?LEKSELL B型，瑞典ELEKTA公司);生物信號(hào)定量記錄分析系統(tǒng)(MS4000U-l型，廣州市龍飛達(dá)科技有限公司)。

1.2 分組 選擇雄性成年貓18只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、癲癇模型組、伽瑪?shù)墩丈浣M。每組6只。正常對(duì)照組貓額功能區(qū)皮質(zhì)注射生理鹽水;癲癇模型組貓額功能區(qū)皮質(zhì)多次注射青霉素制作點(diǎn)燃癲癇模型，伽瑪?shù)墩丈浣M在造模成功后給予伽瑪?shù)墩丈洹Ｓ^察時(shí)間點(diǎn)為伽瑪?shù)墩丈浜?2 w。

1.3 模型制作 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用微量泵持續(xù)異丙酚靜脈麻醉(3 ～7 μg·kg－1·min－1)。麻醉后剃去頭頂毛，固定于動(dòng)物臺(tái)上，消毒，鋪無(wú)菌洞巾。于貓兩耳前緣連線中點(diǎn)前2.0 cm左外側(cè)0.5 cm額葉運(yùn)動(dòng)性功能區(qū)(Sniderrs和Niercerwt的貓立體定位圖譜)做直切口，鉆孔，擴(kuò)大骨窗約1.5×1.5 cm，剪開(kāi)硬膜，暴露右側(cè)十字溝及乙狀前回(運(yùn)動(dòng)性功能區(qū))，于皮層放置MS4000U-1生物信號(hào)定量記錄分析系統(tǒng)鉑金電極，描記正常腦電圖20 min。再用MS4000U-1生物信號(hào)定量記錄分析系統(tǒng)刺激器，刺激強(qiáng)度5～6 V，波寬1 ms，頻率20 Hz，刺激波為斷續(xù)波，以引起對(duì)側(cè)后肢肌肉收縮的刺激點(diǎn)處皮質(zhì)定為運(yùn)動(dòng)中樞。用含有15%亞甲基藍(lán)的生理鹽水稀釋80萬(wàn)IU的青霉素，配制出的青霉素濃度為20萬(wàn)IU/ml，微量加樣器抽取0.05 ml，于實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物乙狀前回皮層無(wú)血管區(qū)以60°角傾斜刺入皮層1 mm約60 s注完，然后用慶大霉素鹽水沖洗，嚴(yán)密縫合硬膜，骨蠟覆蓋骨3窗，以保護(hù)腦組織，縫合頭皮。分別于注射后12 w描記皮層腦電圖。正常對(duì)照組注射生理鹽水。癲癇模型組、伽瑪?shù)墩丈浣M動(dòng)物每隔5 d，重復(fù)注射1次，共5次;正常對(duì)照組同上注射等量生理鹽水作為對(duì)照。

1.4 伽瑪?shù)墩丈?于12 w時(shí)將伽瑪?shù)墩丈浣M貓用3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，將其頭部安裝于Leksell立體定向頭架，用核磁共振儀(MRI)進(jìn)行無(wú)間隔定位掃描，層厚2 mm，掃描圖像經(jīng)計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)傳至Gamma Plan系統(tǒng)制定治療計(jì)劃，確定照射靶區(qū)位于右側(cè)額葉的X-Y-Z坐標(biāo)。然后將固定貓腦的Leksell框架按所定坐標(biāo)安放在伽瑪?shù)抖ㄎ患苌希? mm準(zhǔn)直器，對(duì)靶區(qū)腦組織實(shí)施照射，邊緣劑量15 Gy，等劑量曲線50%。

1.5 行為學(xué)觀察和腦電圖記錄 注射青霉素后觀察記錄每只動(dòng)物的癲癇發(fā)作情況，采用Smialowki 6級(jí)評(píng)分法檢測(cè)行為學(xué)變化，標(biāo)準(zhǔn)如下:0級(jí):沒(méi)有行為上的發(fā)作;Ⅰ級(jí):節(jié)律性點(diǎn)頭或頭部顫搐;Ⅱ級(jí):陣攣性咀嚼;Ⅲ級(jí):頭部顫搐加前肢陣攣性抽搐;Ⅳ級(jí):袋鼠姿勢(shì)(上身直立);Ⅴ級(jí):跌倒;Ⅵ級(jí):強(qiáng)直性驚厥。凡顯示連續(xù)5次Ⅲ級(jí)以上發(fā)作的動(dòng)物為達(dá)到點(diǎn)燃標(biāo)準(zhǔn)。然后采用MS4000 U-1生物信號(hào)定量記錄分析系統(tǒng)記錄各組動(dòng)物皮層腦電圖30 min。記錄點(diǎn)為雙側(cè)十字溝及乙狀前回(參數(shù)設(shè)置:單位μV，高頻濾波 25 Hz，平滑濾波 2點(diǎn)，陷波 50 Hz，增益5 000倍，掃描速度8 div/s，采樣速率110 ms)。

1.6 分光光度計(jì)測(cè)定額葉皮質(zhì)功能區(qū)的γ-氨基丁酸 (γ-GABA)和谷氨酸 (Glu)含量 各組動(dòng)物飼養(yǎng)在溫暖、水和食物充分的環(huán)境中，在觀察完動(dòng)物的發(fā)作及腦電圖后，于12 w時(shí)將正常對(duì)照組及癲癇模型組兩組動(dòng)物處死，快速取出大腦額葉組織勻漿后，用721型分光光度法將樣本中測(cè)定γ-GABA和Glu含量。反應(yīng)體系:1 ml反應(yīng)液中加入1 ml茚三酮-乙二醇甲醚和1滴吡啶，以蒸餾水定容10 ml。37℃恒溫下反應(yīng)20 min后，蒸餾水調(diào)零，于最大吸收波長(zhǎng)為570 nm測(cè)定混合溶液的吸光度值，并以下公式計(jì)算出貓腦額葉組織中γ-GABA和Glu含量。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)及腦電圖結(jié)果所有動(dòng)物未出現(xiàn)死亡;3例出現(xiàn)頭皮切口處少量分泌物;各組動(dòng)物體重?zé)o明顯減輕，飲食正常;正常對(duì)照組在12 w內(nèi)未出現(xiàn)抽搐發(fā)作;癲癇模型組、伽瑪?shù)墩丈浣M在12 w內(nèi)均出現(xiàn)了多次連續(xù)5次Ⅲ級(jí)以上發(fā)作，達(dá)到了點(diǎn)燃標(biāo)準(zhǔn);發(fā)作表現(xiàn)為面部及胡須的抖動(dòng)，流涎，隨之出現(xiàn)左側(cè)上下肢的劇烈強(qiáng)直陣攣，很快泛化到右側(cè)肢體，有時(shí)伴有貓的二便失禁，抽搐發(fā)作時(shí)間持續(xù)約30～50 s，發(fā)作頻率3～4次/w。正常對(duì)照組皮層腦電圖以低波幅快波為主(圖1)。癲癇模型組表現(xiàn)為簇狀棘波放電(圖2)，伽瑪?shù)墩丈浣M顯示癲癇檔放電減少。

圖1 正常對(duì)照組貓皮層腦電圖

圖2 癲癇模型組貓皮層腦電圖

2.2 腦組織內(nèi)γ-GABA和Glu含量測(cè)定 正常對(duì)照組腦組織內(nèi)Glu含量為(11.053±5.915)mol/mg，明顯低于癲癇模型組〔(62.508 ±8.139)mol/mg〕(t=2.236 1，P=0.047 0)。伽瑪?shù)墩丈浣MGlu含量〔(41.272±5.462)mol/mg〕明顯低于模型組(P＜0.05)。正常對(duì)照組腦組織內(nèi)γ-GABA含量為(47.401±9.423)mol/mg，明顯高于癲癇模型組〔(13.201±7.324)mol/mg〕(t=2.798 4，P=0.017 3)。伽瑪?shù)墩丈浣M γ-GABA含量〔(36.736±5.533)mol/mg〕明顯高于模型組(P＜0.05)。

3 討論

功能區(qū)癲癇是致癇灶位于腦功能區(qū)的一類難治性癲癇，臨床上處理比較困難，手術(shù)致殘率較高，并發(fā)癥多〔3〕，而且，一旦功能區(qū)與致癇灶完全重合，手術(shù)將無(wú)法切除病灶;而立體定向放射伽瑪?shù)吨委熅哂卸ㄎ痪_，對(duì)周圍組織損傷小的優(yōu)點(diǎn)〔4〕。

目前，伽瑪?shù)吨委煿δ軈^(qū)癲癇的機(jī)制尚不十分明確，為了進(jìn)一步研究伽瑪?shù)吨委煿δ軈^(qū)癲癇的機(jī)制，需要建立一個(gè)適合伽瑪?shù)墩丈涞墓δ軈^(qū)慢性點(diǎn)燃癲癇模型。盡管癲癇動(dòng)物模型種類繁多，并且在癲癇實(shí)驗(yàn)研究中起著非常關(guān)鍵性作用，但造成癲癇的遺傳和獲得性因素十分復(fù)雜，非任何一種動(dòng)物模型能代表。Sarkisian〔5〕認(rèn)為，當(dāng)一個(gè)動(dòng)物被當(dāng)作特定的人類癇性發(fā)作及癲癇模型時(shí)，他應(yīng)當(dāng)具備4個(gè)標(biāo)準(zhǔn):①它應(yīng)當(dāng)具備特征性的腦電圖改變。②病因相似。③對(duì)那些由于特殊的病理改變(如局灶損傷和皮層發(fā)育不良)所引起的癲癇，動(dòng)物模型也應(yīng)具有相似的病理改變。④模型動(dòng)物所表現(xiàn)的行為特征，包括癇性發(fā)作樣行為、短程及長(zhǎng)程行為缺失，應(yīng)在某種程度上反映出人類行為表現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)采用貓功能區(qū)慢性點(diǎn)燃癲癇模型，而不是大鼠癲癇模型，是因?yàn)樨埬X結(jié)構(gòu)與人腦結(jié)構(gòu)非常相似，在進(jìn)化上更接近人類;相對(duì)于大鼠而言，貓腦體積較大，大腦半球已出現(xiàn)了明顯的溝回，而且行動(dòng)靈活、能發(fā)聲，有利于觀察術(shù)后行為學(xué)改變及功能保護(hù)情況〔6〕。

伽瑪?shù)吨委煿δ軈^(qū)癲癇是一個(gè)緩慢起效的過(guò)程，起效時(shí)間窗在8～12 w左右，因此，急性癲癇模型不適合伽瑪?shù)吨委煹膶?shí)驗(yàn)研究。青霉素作為一種經(jīng)典致癇劑，其急性癲癇模型已獲公認(rèn)〔7〕。本實(shí)驗(yàn)采用多次注射青霉素成功建立了慢性癲癇模型。另外，為了建立功能區(qū)模型，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)貓立體定位圖譜，解剖定位貓腦額葉乙狀前回為負(fù)載肢體運(yùn)動(dòng)的皮質(zhì)功能區(qū)，并用MS4000U-1生物信號(hào)定量記錄分析系統(tǒng)刺激器刺激相應(yīng)腦皮質(zhì)，以引起對(duì)側(cè)后肢肌肉收縮的刺激點(diǎn)處皮質(zhì)定為運(yùn)動(dòng)中樞，在造模過(guò)程中，將一定劑量青霉素注射此處，引起貓的抽搐發(fā)作，能夠很好地模擬臨床上人類致癇灶位于中央溝之前中央前回皮質(zhì)的功能區(qū)癲癇。此外，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物能夠很好地完成伽瑪?shù)墩丈涞娜^(guò)程，從頭架固定到伽瑪?shù)墩丈?，?shí)驗(yàn)動(dòng)物無(wú)明顯不適反應(yīng);MRI影像上可以清晰顯示貓的額葉功能區(qū)皮質(zhì)，用4 mm準(zhǔn)直器，等劑量曲線50%可以順利包裹照射靶點(diǎn)，進(jìn)行精確照射，保證了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和有效性。

γ-GABA和Glu分別是哺乳動(dòng)物大腦皮質(zhì)主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)和興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。持續(xù)刺激神經(jīng)元可以導(dǎo)致鈉潴留及膜去極化，鈉潴留又可以導(dǎo)致細(xì)胞外鉀濃度升高，并對(duì)鄰近細(xì)胞產(chǎn)生有效去極化。神經(jīng)元的膜去極化和離子運(yùn)動(dòng)可以使Glu等去極化物質(zhì)的效應(yīng)更加明顯，而γ-GABA等超極化物質(zhì)的效應(yīng)表現(xiàn)的很小。這就使在同一神經(jīng)元內(nèi)的Glu介導(dǎo)的興奮性增強(qiáng)，而γ-GABA介導(dǎo)的抑制性減弱，導(dǎo)致癲癇發(fā)作性放電的產(chǎn)生及維持〔8〕。若一個(gè)足夠大的神經(jīng)元群體在青霉素的直接作用下，打亂了正常的興奮性和抑制性的平衡，就會(huì)建立一個(gè)正反饋環(huán)，導(dǎo)致病灶群體的同步化發(fā)作性放電，這種放電達(dá)一定強(qiáng)度就可以驅(qū)動(dòng)鄰近神經(jīng)元，導(dǎo)致癲癇活動(dòng)的傳播。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)癲癇模型組興奮性神經(jīng)遞質(zhì)Glu含量增加，而抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-GABA含量降低，推斷青霉素致癇的作用機(jī)制為:青霉素改變了腦功能區(qū)皮質(zhì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的興奮-抑制平衡，引起抑制性突觸活動(dòng)減弱或興奮性突觸活動(dòng)增強(qiáng)，從而導(dǎo)致神經(jīng)元興奮性增高。當(dāng)神經(jīng)元興奮性突觸后電位綜合超過(guò)一定閾值即可產(chǎn)生陣發(fā)性去極化飄移，從而產(chǎn)生癇樣放電及癲癇癥狀。

綜上，貓腦額葉功能區(qū)皮質(zhì)多次注射致癇劑青霉素，成功建立了慢性癲癇模型，并能滿足伽瑪?shù)墩丈涞男枰?，此模型不足之處在于造模時(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)動(dòng)物有一定損傷，有待進(jìn)一步改進(jìn)完善。

1 李敏杰.癲癇的伽瑪?shù)吨委煛睯〕.中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2011;6(20):38-40.

2 霍文滔，梁軍潮.伽瑪?shù)斗派渲委煱d癇的作用機(jī)制研究進(jìn)展〔J〕.立體定向和功能性神經(jīng)外科雜志，2010;23(4):246-8.

3 Kim YH，Kim CH，Kim JS.Resection frequency map after awake resective surgery for non-lesional neocortical epilepsy involving eloquent areas〔J〕.Acta Neurochir(Wien)，2011;153(9):1739-49.

4 Ganz JC，Reda WA.Radionecrosis following gamma knife treatment for mesial temporal lobe epilepsy〔J〕.Br J Neurosurg，2011;25(5):649-51.

5 Sarkisian MR.Overview of the current animal models for human seizure and epileptic disorders〔J〕.Epilepsy Behav，2001;2(3):201-16.

6 董長(zhǎng)征，趙文清，岳向勇，等.伽瑪?shù)墩丈鋵?duì)正常老齡貓額葉皮質(zhì)組織形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2010;30(10):2954-6.

7 董長(zhǎng)征，趙文清，李文玲，等.伽瑪?shù)墩丈湔T導(dǎo)貓功能區(qū)皮質(zhì)細(xì)胞凋亡研究〔J〕.中國(guó)微侵襲神經(jīng)外科雜志，2010;15(1):33-6.

8 Fassio A，Raimondi A，Lignani G.Synapsins:from synapse to network hyperex citability and epilepsy〔J〕.Semin Cell Dev Biol，2011;22(4):408-15.