王 蓓 李建立 賈立剛 黃 黛 李紅艷 閆 萍 秦 英 邢邯英(河北省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北 石家莊 05005)

阿司匹林為非甾體類(lèi)消炎藥，最近流行病學(xué)研究證實(shí)阿司匹林及其他非甾體類(lèi)消炎藥具有降低腫瘤發(fā)病率的作用〔1～3〕。本研究以人宮頸癌Hela細(xì)胞為研究對(duì)象，探討阿司匹林對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞系、藥物及試劑 人宮頸癌Hela細(xì)胞，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心。阿司匹林購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;RPMI-1640培養(yǎng)基為Hyclone產(chǎn)品;PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組 接種宮頸癌Hela細(xì)胞于含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37℃，5%CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)約90%融合時(shí)，以0.25%胰酶消化，每周傳代2～3次。

實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和阿司匹林干預(yù)組:①對(duì)照組:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞以5×105/瓶的密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，24 h后更換含1% 乙醇的RPMI-1640培養(yǎng)基，然后繼續(xù)培養(yǎng)48 h;②阿司匹林干預(yù)組:細(xì)胞接種24 h后更換含有阿司匹林濃度分別為1.0、5.0、10.0 mmol/L的RPMI-1640培養(yǎng)基(阿司匹林純品溶于無(wú)水乙醇中，過(guò)濾除菌，再用RPMI-1640培養(yǎng)基分別配置成終濃度為1、5、10 mmol/L，無(wú)水乙醇最大濃度為1%)，再置于37℃，CO2含量5%飽和濕度的培養(yǎng)箱中48 h。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)Hela細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期 收集細(xì)胞并用70% 的預(yù)冷酒精固定。采用碘化丙啶(PI)一步插入法DNA定量熒光染色方法，染液中含 PI 50 mg/ml，RNA酶10 μl/ml，Triton-X100 1.0%。上機(jī)前先除去樣本中70%的乙醇，調(diào)整每份樣品的細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)。每份樣本中加入DNA染液500 μl，在4℃冰箱染色30 min，以500目銅網(wǎng)過(guò)濾成單細(xì)胞懸液。FACS-420型流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期，每份樣本檢測(cè)1×104個(gè)細(xì)胞，每組共檢測(cè)6個(gè)樣本，重復(fù)3遍。測(cè)得的數(shù)據(jù)和圖形輸入BD公司提供的流式細(xì)胞分析軟件，以低于G1期DNA含量細(xì)胞為凋亡細(xì)胞，應(yīng)用相應(yīng)程序進(jìn)行資料處理。

1.2.3 RT-PCR技術(shù)檢測(cè)凋亡相關(guān)基因bcl-2和bax表達(dá)的變化 Trizol一步法提取各組細(xì)胞總RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)總體積為25 μl，包括 RNA 2 μg。取逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，分別進(jìn)行bcl-2和 bax基因的擴(kuò)增。bcl-2引物序列:上游引物 5'-CGACTTCGCCGAGATGTCCAGCCAG-3';下游引物5'-ACTTGTGGCCCAGATAGGCACCCAG-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為:389 bp。bax引物序列:上游引物5'-tttgcttcagggtttcatcc-3'，下游引物5'-cagttgaagttgccgtcaga-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為246 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖電泳，UVP凝膠顯像儀掃描并進(jìn)行圖像分析。用目的基因與β-actin吸光度的比值代表目的基因的相對(duì)表達(dá)含量。

2 結(jié)果

2.1 阿司匹林誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡結(jié)果各劑量的阿司匹林作用Hela細(xì)胞48 h后，在DNA直方圖上G1期峰前出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡峰即亞G1期峰，說(shuō)明阿司匹林可誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡。與對(duì)照組凋亡率(4.13% ±0.76%)相比，阿司匹林干預(yù)組Hela細(xì)胞凋亡率(11.71% ±0.86%，18.15% ±0.46%，30.81% ±0.46%)明顯增高(P＜0.05)，且隨濃度增加凋亡率也隨之增加。

2.2 阿司匹林對(duì)Hela細(xì)胞周期的影響 Hela細(xì)胞經(jīng)不同濃度阿司匹林作用48 h后，細(xì)胞周期發(fā)生明顯改變(表1)，隨著阿司匹林濃度增加，G0/G1期細(xì)胞比例下降，G2/M期細(xì)胞比例升高(P＜0.05)。

表1 各組細(xì)胞細(xì)胞周期比較(± s，n=6)

表1 各組細(xì)胞細(xì)胞周期比較(± s，n=6)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.01;與阿司匹林干預(yù)組(1.0 mmol/L)比較:2)P＜0.05

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2.3 阿司匹林對(duì)Hela細(xì)胞bcl-2和bax基因mRNA表達(dá)的影響 圖 1，圖 2可見(jiàn)，對(duì)照組 bcl-2/β-actin的 IOD比值為(0.725±0.332)，1.0、5.0 mmol/L濃度的阿司匹林作用后Hela細(xì)胞的bcl-2表達(dá)均明顯下調(diào)，IOD比值分別達(dá)到(0.241±0.113)和(0.584±0.18)，與對(duì)照組相比有顯著差異(P＜0.05)。對(duì)照組Hela細(xì)胞的bax條帶的積光密度標(biāo)化后為(0.222±0.12)，1.0、5.0 mmol/L濃度的阿司匹林作用后 Hela細(xì)胞的bax條帶的積光密度標(biāo)化后分別為(0.129±0.217)和(0.644±0.24)，較對(duì)照組表達(dá)明顯升高(P＜0.05)。

圖1 各組細(xì)胞bcl-2 mRNA的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 各組細(xì)胞bax mRNA的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

3 討論

本實(shí)驗(yàn)是以阿司匹林能夠?qū)Χ喾N腫瘤細(xì)胞有較好的抑制作用為科研基礎(chǔ)〔4～6〕，以相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道阿司匹林能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡為依據(jù)〔7〕，以阿司匹林能否直接抑制體外培養(yǎng)的宮頸癌細(xì)胞株增殖生長(zhǎng)，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡為切入點(diǎn)〔8〕。阿司匹林具有抗結(jié)腸癌、胃癌、食管癌的作用，但有關(guān)阿司匹林抗宮頸癌的研究國(guó)內(nèi)外還很少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示阿司匹林可誘導(dǎo)宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡。近年來(lái)許多文獻(xiàn)報(bào)道，DNA損傷因子包括化療藥物和放療等，在損傷DNA的同時(shí)還可以引起腫瘤細(xì)胞在G2/M期阻滯，甚至誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔9〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示阿司匹林作用于Hela細(xì)胞在細(xì)胞進(jìn)入DNA合成后期可引起DNA損傷，使細(xì)胞停滯在 G2/M 期〔10〕。而朱慧明等〔5〕發(fā)現(xiàn)阿司匹林使人肺腺癌細(xì)胞株SPCA-1在G0/G1期增多，S期和G2/M期細(xì)胞減少。

為進(jìn)一步探討阿司匹林誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)研究了不同濃度阿司匹林作用于Hela細(xì)胞前后，bcl-2和bax基因mRNA表達(dá)的變化。bcl-2基因蛋白是一種細(xì)胞內(nèi)膜蛋白，主要位于線(xiàn)粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜上。bcl-2表達(dá)于多種腫瘤組織中，它的抗凋亡機(jī)制是因?yàn)閎cl-2基因蛋白能夠增強(qiáng)線(xiàn)粒體膜電位，抑制鈣離子釋放，阻止核酸內(nèi)切酶活化，從而具有抗凋亡作用。Bax屬于bcl-2家族成員，其作用與bcl-2相反，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。bax蛋白的組織表達(dá)與分布與bcl-2相似，其促凋亡機(jī)制是直接激活死亡效應(yīng)因子caspases或是通過(guò)改變細(xì)胞膜通透性引起細(xì)胞色素C釋放并使某些離子和小分子物質(zhì)通過(guò)細(xì)胞膜。體內(nèi)bcl-2和bax的比例調(diào)節(jié)了凋亡的發(fā)生。當(dāng)bcl-2過(guò)度表達(dá)時(shí)，細(xì)胞具有抗凋亡作用;當(dāng)bax占優(yōu)勢(shì)時(shí)，細(xì)胞容易在誘導(dǎo)劑的作用下發(fā)生凋亡。本實(shí)驗(yàn)表明阿司匹林誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡是通過(guò)下調(diào)bcl-2和上調(diào)bax的基因表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，并且隨著阿司匹林濃度的升高，下調(diào)bcl-2基因表達(dá)及上調(diào)bax基因表達(dá)的作用越明顯。

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2 許 紅，安翠平，陳瑞敏.阿司匹林對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡及Bcl-2/bax基因mRNA表達(dá)的影響〔J〕.河北醫(yī)藥，2009;31(4):404-6.

3 Lee SK，Park MS，Nam MJ.Aspirin has antitumor effects via expression of calpain gene in cervical cancer cells〔J〕.J Oncol，2008;2008:285374.

4 Gupta RA，Tejada LV.Cyclooxygenase-1 is overexpressed and promotes angiogenic growth factor production in ovarian cancer〔J〕.Cancer Res，2003;63(3):906-11.

5 朱慧明，吳 鐵，崔 燎.阿司匹林誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞株SPC-1凋亡研究〔J〕.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2004;20(6):640-3.

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