王績(jī)英 曾錦榮 王昌明 莫碧文 劉春妮 王 濤 (桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣西 桂林 541001)

近年來(lái)研究PPARα外源性激動(dòng)劑貝特類藥物除了傳統(tǒng)降血脂作用外，還有許多潛在的治療作用，如抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗炎癥反應(yīng)、抑制血管生成、抑制腫瘤細(xì)胞增殖等，特別是其抗腫瘤作用逐漸受到研究者的關(guān)注。本研究觀察PPARα激動(dòng)劑非諾貝特聯(lián)合傳統(tǒng)化療藥順鉑對(duì)肺癌移植瘤生長(zhǎng)的影響，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料 人肺癌A549細(xì)胞(本實(shí)驗(yàn)室自存)，BALB/c-nu裸鼠，24只，4～6周齡，體重16～18 g，購(gòu)于桂林醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(合格證號(hào)碼:SCXK桂2007-0001)，飼養(yǎng)于SPF級(jí)無(wú)菌飼養(yǎng)室，用高壓滅菌處理的飲用水飼料定期喂養(yǎng)。非諾貝特購(gòu)于美國(guó) Sigma公司(批號(hào):BCBB4253)，順鉑購(gòu)于齊魯制藥廠(批號(hào):H37021358)。新生牛血清為杭州四季青產(chǎn)品，DMEM高糖培養(yǎng)基為美國(guó) HyClone公司產(chǎn)品。鼠抗人Bcl-2免疫組化單克隆抗體、即用型快捷免疫組化MaxVisionTM試劑盒(鼠/兔)、DAB試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)，鼠抗人PPARα單克隆抗體(購(gòu)自美國(guó)Millipore公司)，鼠抗人 NF-κB多克隆抗體(美國(guó) SantaCruz公司)，辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)、ECL超敏發(fā)光液(均購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司)，蛋白提取試劑盒(WIP裂解液)、預(yù)染蛋白Marker、actin抗體(購(gòu)自碧云天生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 A549細(xì)胞培養(yǎng) 37℃，5%CO2，飽和濕度下，在含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。取細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，以0.25%胰酶消化，收集細(xì)胞以4℃、1 200 r/min離心5 min后懸浮于PBS中，調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×108個(gè)/ml。

1.2.2 裸鼠移植瘤模型的建立 嚴(yán)格的無(wú)菌操作條件下，于每只裸鼠的左腋皮下接種0.2 ml腫瘤細(xì)胞的懸液，含細(xì)胞數(shù)約2.0×107個(gè)，接種后嚴(yán)密觀察裸鼠的一般狀態(tài)，腫瘤部位有無(wú)出血和破潰，HE染色確認(rèn)移植瘤來(lái)源。以皮下結(jié)節(jié)體積≥200 mm3為成瘤標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組及用藥方案 接種第14天，將成瘤的24只裸鼠隨機(jī)分為:生理鹽水對(duì)照組(A組)，非諾貝特200 mg/kg(B組)，順鉑2 mg/kg(C組)，非諾貝特200 mg/kg+順鉑2 mg/kg(D組)，每組6只。實(shí)驗(yàn)組給予相應(yīng)劑量非諾貝特生理鹽水懸濁液灌胃1次/d次、順鉑按照實(shí)驗(yàn)用量溶于生理鹽水中隔天給藥，連續(xù)給藥3 w。對(duì)照組灌胃、腹腔注射均以相同體積的生理鹽水代替。非諾貝特和順鉑使用劑量均依據(jù)前期的實(shí)驗(yàn)總結(jié)的數(shù)據(jù)。給藥期間每隔4 d測(cè)量移植瘤結(jié)節(jié)的長(zhǎng)徑(a)、短徑(b)，按V=(ab2)π/6公式計(jì)算出移植瘤的體積，描繪各組移植瘤相對(duì)生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 Western印跡檢測(cè)各組移植瘤中PPARα、NF-κB蛋白的表達(dá)。取4組組織標(biāo)本置于研缽中，液氮反復(fù)研磨，加入WIP裂解液冰上裂解30 min，4℃ 下12 000 r/min離心15min，取上清分裝于0.5 ml離心管中并于－20℃保存。在SDS-PAGE凝膠電泳前采用BCA法定量蛋白樣品，用裂解液將蛋白樣品調(diào)成相同濃度，加入相同體積上樣緩沖液，沸水中加熱使蛋白質(zhì)變性。Western印跡每個(gè)樣本取等量蛋白進(jìn)行(PPARα、NF-κB用10%)SDS-PAGE凝膠電泳1.5 h，90 mA轉(zhuǎn)膜45 min(半干轉(zhuǎn)法)，凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，脫脂奶粉封閉4℃過(guò)夜，分別加入一抗 PPARα(1∶4 000)、NF-κB(1∶200)封閉2 h，洗膜30 min，加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔/小鼠IgG的二抗封閉1 h，一二抗用磷酸平衡鹽吐溫濃縮緩沖溶液(PBST)按說(shuō)明書(shū)稀釋，洗膜30 min，化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)發(fā)光，進(jìn)行Western印跡分析。用凝膠成像系統(tǒng)拍照并進(jìn)行灰度值計(jì)算分析，以PPARα、NF-κB分別與β-actin的比值作為該因子相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。

1.2.5 免疫組化法檢測(cè)Bcl-2蛋白的表達(dá) 采用免疫組化SP法，方法步驟嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行(用PBS稀釋一抗)，用等量PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。操作流程:石蠟切片厚度為5 μm，常規(guī)脫蠟至水，置于0.01 mol/L pH 6.0的檸檬酸鹽緩沖液中進(jìn)行高壓加熱抗原修復(fù)〔1〕，PBS漂洗3次，3%過(guò)氧化氫避光封閉15 min，PBS漂洗3次，滴加正常血清封閉液，置室溫10 min，甩干再加入稀釋好的相應(yīng)蛋白的單抗，置室溫60 min，PBS漂洗3次，加入即用型酶標(biāo)二抗，置室溫15 min，PBS漂洗，加入試劑 DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片，鏡下拍照。判斷標(biāo)準(zhǔn):Bcl-2染色陽(yáng)性細(xì)胞為胞質(zhì)棕黃色或棕褐色顆粒沉著，從每組處理因素中隨機(jī)選3只荷瘤鼠的切片，×200倍光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)百分比。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用方差分析進(jìn)行多樣本均數(shù)間的多重比較，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以±s表示。

2 結(jié)果

2.1 荷瘤鼠的一般情況 接種后10 d，可見(jiàn)接種部位實(shí)性小結(jié)節(jié)，約5 mm×5 mm，隨后結(jié)節(jié)逐漸增大，實(shí)驗(yàn)第14天成瘤。給藥期間，各組裸鼠的一般狀態(tài)良好、皮膚紅潤(rùn)、食欲旺盛、反應(yīng)靈敏全身情況與對(duì)照組無(wú)明顯差異。

2.2 各組藥物對(duì)裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)的影響 B、C、D組的瘤體體積均低于A組(P＜0.05)，D組的抑瘤作用進(jìn)一步增強(qiáng)。見(jiàn)圖1。

圖1 裸鼠皮下移植瘤相對(duì)生長(zhǎng)曲線

2.3 藥物對(duì)各組移植瘤中PPARα、NF-κB蛋白表達(dá)的影響Western印跡結(jié)果經(jīng)灰度值測(cè)定分析示:B、D組PPARα蛋白的表達(dá)呈明顯增強(qiáng)(P＜0.01)，四組中NF-κB蛋白表達(dá)呈明顯下調(diào)趨勢(shì)(P＜0.01)，與B、C組相比，D組NF-κB蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.01)。見(jiàn)表1，圖2、圖3。

表1 不同處理因素對(duì)移植瘤PPARα、NF-κB蛋白表達(dá)的灰度值分析(n=6，±s)

表1 不同處理因素對(duì)移植瘤PPARα、NF-κB蛋白表達(dá)的灰度值分析(n=6，±s)

與A組比較:1)P＜0.01;與單用藥組比較:2)P＜0.01

組別 PPARα NF-κB A組0.955±0.006 1.613±0.015 B組 1.494±0.0071) 1.103±0.0051)C組 1.062±0.012 0.700±0.0031)D組 2.072±0.0181)2) 0.043±0.0041)2)

圖2 不同處理因素對(duì)移植瘤PPARα蛋白表達(dá)的影響

圖3 不同處理因素對(duì)移植瘤NF-κB蛋白表達(dá)的影響

2.4 免疫組化法檢測(cè)不同處理因素下腫瘤組織中Bcl-2的表達(dá)情況 以Bcl-2表達(dá)的陽(yáng)性率作為移植瘤中腫瘤細(xì)胞的抗凋亡情況。免疫組化結(jié)果示用藥組與A組相比腫瘤組織中Bcl-2的表達(dá)呈下調(diào)趨勢(shì)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.01)，其中D組與單用藥組相比，Bcl-2的表達(dá)下調(diào)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 Bcl-2染色檢測(cè)不同用藥組中移植瘤細(xì)胞的抗凋亡情況(×400)

3 討論

PPARα是第一個(gè)被鑒別出來(lái)PPAR的亞型，屬于Ⅱ型核受體，主要調(diào)控與脂類代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，參與脂肪酸的氧化，糖原、氨基酸和酮體的合成，并通過(guò)這些途徑來(lái)調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。近來(lái)許多研究表明，PPARα的內(nèi)源性或外源性配體(激動(dòng)劑)在體外實(shí)驗(yàn)中可抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)〔2～6〕，但其抗腫瘤機(jī)制尚不很清楚。

非諾貝特是PPARα的合成激動(dòng)劑，故PPARα是該藥的一個(gè)作用靶點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明PPARα被特異性激活而發(fā)揮調(diào)控作用。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可以介導(dǎo)多種促進(jìn)有絲分裂、血管新生的細(xì)胞因子的分泌，大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)NF-κB在多種腫瘤組織中通過(guò)遺傳學(xué)改變或信號(hào)傳導(dǎo)異常，而持續(xù)性激活或出現(xiàn)異常的核定位，它的激活可上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、MMPS、uPA、CXCR4、Bcl-2 等的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管的形成，提高腫瘤細(xì)胞的遷移能力，降解周圍基質(zhì)，誘導(dǎo)上皮間變，對(duì)腫瘤的轉(zhuǎn)移及生長(zhǎng)起促進(jìn)作用。有研究顯示PPARα激動(dòng)劑可能通過(guò)上調(diào)核因子抑制蛋白(I-κBa)，從而抑制NF-κB的活性來(lái)實(shí)現(xiàn)其抗腫瘤效應(yīng)的〔7，8〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示非諾貝特可通過(guò)抑制NF-κB的活性，進(jìn)而下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡及阻礙腫瘤血管形成，從而增強(qiáng)順鉑的抗腫瘤作用。

綜上所述，非諾貝特可抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，與順鉑聯(lián)用抑瘤作用更顯著，其機(jī)制可能是通過(guò)激活PPARα信號(hào)途徑抑制NF-κB的活性從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

1 齊文娟，申 洪.提高陳舊性石蠟標(biāo)本抗原檢出率的抗原修復(fù)方法〔J〕. 實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2010;26(10):1761-3.

2 David LM，Vander M，Tatjana D，et al.Profiling of promoter occupancy by PPARa in human hepatoma cells via ChIP-chip analysis〔J〕.Nucleic Acids Res，2010;38(9):2839-50.

3 Sean RP，Navin V，Songtao Yu，et al.PPARα:energy combustion，hypolipidemia，inflammation and cancer〔J〕.NRS，2010;8(1):1-21.

4 Youssef J，Badr M.Peroxisome proliferator-activated receptors and cancer challenges and opportunities〔J〕.Pharmacol，2011;164(1):68-82.

5 Panigrahy D，Kaipainen A，Huang S，et al.PPARa agonist fenofibrate suppresses tumor growth through direct and indirect angiogenesis inhibition〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2008;105(3):985-90.

6 Ambra P，Vlad P，Yang SL，et al.The Anti-tumorigenic properties of peroxisomal proliferator-activated receptor α are arachidonic acid epoxygenase-mediated〔J〕.Biol Chem，2010;285(17):12840-50.

7 Cuzzocrea S，Bruscoli S，Mazzon E，et al.Peroxisome proliferator-activated receptor-alpha contributes to the anti-inflammatory activity of glucocorticoids〔J〕.Mo Pharmacol，2008;73(2):323-37.

8 Zak Z，Gelebart P，Lai R.Fenofibrate induces effective apoptosis in mantle cell lymphoma by inhibiting the TNFα/NF-κB signalin gaxis〔J〕.Leukemia，2010;24(8):1476-86.