田少江 干艷捷 劉輝輝 王黎萍 沈建明 李駿峰

(湖北醫(yī)藥學院附屬人民醫(yī)院腎內科，湖北 十堰 442000)

早期糖尿病腎病(DN)最突出的病理改變是腎小球肥大。最近研究發(fā)現(xiàn)，DN早期腎小球內存在廣泛的新生血管形成，這些新生血管可能是腎小球肥大的結構基礎〔1〕。由于我們的早期研究發(fā)現(xiàn)，與活血化瘀類中藥赤芍提取物類似的棓丙酯可減輕DN患者蛋白尿、減輕早期DN腎小球肥大，對DN發(fā)揮保護作用〔2，3〕，本研究應用DN大鼠模型，探討棓丙酯對DN腎小球內皮增殖和新生血管形成的干預效果，探索棓丙酯保護DN的機制。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑 清潔級雄性SD大鼠購自華中科技大學實驗動物中心;兔抗大鼠血管內皮生長因子-A(VEGF-A)、小鼠抗大鼠CD31抗體及相應的羊抗兔和羊抗小鼠熒光標記和酶標記二抗均購自武漢博士德生物工程有限公司;大鼠磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)、VEGF-A引物和Marker由大連TaKaRa公司合成;鏈脲佐菌素和棓丙酯均購自Sigma公司;大鼠白蛋白尿試劑盒購自上海瑞齊生物科技公司;尿肌酐檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 動物模型的制備和處理 對16只SD大鼠應用鏈脲佐菌素(60 mg/kg)一次性腹腔注射建立糖尿病模型(3 d后空腹血糖≥16.7 mmol/L者，確定為DM模型成功)，另用7只作正常對照組。造模成功的大鼠隨機分為兩組，一組為模型組，另一組為治療組。治療組大鼠給予棓丙酯(2 mg/kg)腹腔注射治療(6次/w)。于模型成功后8 w代謝籠收集24 h尿液，用試劑盒檢測尿白蛋白和尿肌酐。尿液收集完成后殺鼠取腎，取腎前用生理鹽水充分灌洗腎臟。將獲得的腎組織分為2部分:一部分立即作4%多聚甲醛固定;另部分－80℃保存，分離腎小球。

1.3 PAS染色 取多聚甲醛固定標本制作常規(guī)石蠟切片，PAS染色后評價腎小球肥大，系膜基質增生程度。顯微鏡下觀察，根據(jù)腎小球肥大和血管襻增加程度進行損傷評分。

1.4 免疫熒光染色 PBS浸洗冰凍切片OTC三次，用檸檬酸液進行抗原熱修復后入PBS，無關血清封閉30 min，滴加小鼠抗大鼠 CD31抗體，4℃過夜，37℃復溫30 mim，PBS浸洗3次，滴加熒光素標記的羊抗小鼠二抗，37℃孵育2 h，PBS浸洗后加甘油PBS封片，熒光顯微鏡下觀察并照相，輸入電腦后以熒光面積值表示熒光強度。

1.5 RT-PCR檢測 篩網(wǎng)提取各組腎組織的腎小球，各取100 mg小球組織加入Trizol 1 ml提取總RNA，參照說明書進行RT-PCR檢測。其所用引物分別為:GAPDH，上游引物5'-ACC ATG GAG AAG GCT-3'，下游引物5'-AGT GTA GCC CAG GAT-3'產(chǎn)物大小522 bp。VEGF-A上游引物5'-TGC ACC CAC GAC AGA AGG GGA-3'，下游引物:5'-TCA CCG CCT TGG CTT GTC ACA-3'產(chǎn)物片段大小429 bp。

1.6 Western印跡 取0.1 g腎小球組織加5倍體積的細胞裂解液，提取組織總蛋白。取100 μg總蛋白行SDS-PAGE電泳后，將膠板取下，轉移緩沖液洗滌10 min，在60 mA的電流下將蛋白轉印到硝酸纖維素膜上，經(jīng)Tris鹽酸緩沖液沖洗2遍，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉，4℃過夜。將膜與兔抗鼠VEGF-A、β-actin抗體(1∶400)4℃孵育過夜，TBST洗脫3次，再與二抗(HRP標記的羊抗兔IgG抗體，稀釋度為1∶2 000)室溫孵育1 h，TBST溶液洗脫3次，與ECL化學發(fā)光劑作用后膠片顯影，掃描電泳條帶，用Band leader軟件分析電泳條帶光密度。

1.7 統(tǒng)計學方法采用SPSS11.5軟件。各組數(shù)據(jù)均以±s表示，各組間計量資料應用方差分析進行統(tǒng)計，相關分析采用Spearman相關分析。

2 結果

2.1 腎小球病理變化 腎組織PAS染色顯示模型組大鼠較正常對照組腎小球普遍肥大，毛細血管襻增多增粗，系膜基質增加較明顯，而治療組較模型組腎小球肥大有所減輕，毛細血管襻減少，系膜基質也有所減少。見圖1。

圖1 三組大鼠腎小球病理變化(PAS染色，×400)

2.2 腎小球內皮細胞增殖狀態(tài) 以內皮標志分子CD31所進行的血管內皮細胞標記顯示，糖尿病腎病組內皮細胞及新生內皮細胞較正常對照組明顯增多，而棓丙酯治療組內皮細胞及新生血管較模型組顯著減少。見圖2。

圖2 三組大?鼠腎小球血管增殖狀態(tài)

2.3 尿白蛋白排泄率變化 各組動物的尿白蛋白水平經(jīng)尿肌酐標化后表示為:正常對照組(155.3±37.8)μg/mg creatinine;模型組(483.7±87.4)μg/mg creatinine;治療組(261.9±23.5)μg/mg creatinine。模型組較正常對照組顯著升高(P＜0.01)，而治療組又較模型組顯著下降(P＜0.01);模型組中各動物的尿白蛋白水平與CD31的熒光強度成正相關(r=0.62，P ＜0.01)。

2.4 腎小球VEGF的表達 在mRNA水平上，模型組腎小球VEGF-A表達明顯升高，但在治療組這種升高受到顯著抑制;在蛋白水平上，模型組腎小球VEGF-A表達也明顯升高，但在治療組這種升高也受到顯著抑制。見圖3。

圖3 VEGF-A mRNA及蛋白在各組動物腎小球中的表達

3 討論

DN是目前最常見的繼發(fā)性腎小球損害性疾病，由于其進展快、并發(fā)癥多，是目前導致慢性腎衰竭的主要原因，尤其是在老年透析患者中，由DN導致的腎衰竭遠遠超過其他病因。自血管緊張素轉化酶抑制劑(ACEI)和轉化酶受體拮抗劑(ARB)類藥物應用以來，針對DN的治療雖取得了一定的療效，但總體上看，現(xiàn)今對DN的防治措施仍十分缺乏。本研究和我們前期的研究均發(fā)現(xiàn)，與活血化瘀類中藥提取物結構相同的棓丙酯可在一定程度上減輕DN患者的蛋白尿，抑制DN大鼠的腎小球肥大，提示棓丙酯可能通過減輕腎小球內毛細血管損害而對DN發(fā)揮保護作用〔2，3〕，本研究進一步探討了棓丙酯對早期DN的保護作用機制，結果表明棓丙酯可明顯減輕腎小球內皮增殖和新生血管程度，顯著降低腎小球內VEGF的表達水平。

VEGF是最強的引起內皮細胞活化增殖的因子之一，DN狀態(tài)下腎小球內足細胞表達的VEGF增加是促進內皮活化增殖的主要動力〔4〕。研究表明，下調腎小球內VEGF表達，或阻滯VEGF受體可抑制DN的進展〔5，6〕。在本研究中，不論是在mRNA水平還是在蛋白水平上，棓丙酯都可以下調VEGF的表達，這種下調作用可能就是導致本研究結果所觀察到的腎小球新生血管顯著減少的原因。內皮增殖和新生血管的減少可能從結構上防止了糖尿病微血管病變對腎小球濾過膜的損害，可能是促成本研究所見的白蛋白尿水平下降的原因。白蛋白尿既是DN時腎小球損害程度指標，也作為一種DN預后判斷指標〔7〕，白蛋白尿的減低必然使棓丙酯對DN的保護作用更加明確。

事實上，棓丙酯可能不僅僅是從抑制VEGF表達的角度抑制DN的進展，研究表明，棓丙酯可能還通過恢復腎小球內eNOS活性，提高腎小球組織內一氧化氮水平，阻礙內皮細胞活化增殖而對DN發(fā)揮保護作用〔3〕。從目前的研究結果判斷，棓丙酯可能通過多個途徑維護早期DN腎小球結構和功能的完整，其他效應有待進一步探討。

1 Nakagawa T，Kosugi T，Haneda M，et al.Abnormal angiogenesis in diabetic nephropathy〔J〕.Diabetes，2009;58(7):1471-8.

2 Tian S，Gan Y，Li J，et al.Imbalance of glomerular VEGF-NO axis in diabetic rats:prevention by chronic therapy with propyl gallate〔J〕.J Nephrol，2011;24(4):499-506.

3 田少江，王黎萍，沈建明，等.棓丙酯對糖尿病腎病大鼠腎小球血管內皮生長因子——一氧化氮軸的維護作用〔J〕.中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2010;20(22):3400-3.

4 Nakagawa T.Uncoupling of the VEGF-endothelial nitric oxide axis in diabetic nephropathy:an explanation for the paradoxical effects of VEGF in renal disease〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol，2007;292(6):F1665-72.

5 Nasu T，Maeshima Y，Kinomura M，et al.Vasohibin-1，a negative feedback regulator of angiogenesis，ameliorates renal alterations in a mouse model of diabetic nephropathy〔J〕.Diabetes，2009;58(10):2365-75.

6 Tesch GH，Lim AK.Recent insights into diabetic renal injury from the db/db mouse model of type 2 diabetic nephropathy〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol，2011;300(2):301-10.

7 de Zeeuw D，Remuzzi G，Parving HH，et al.Proteinuria，a target for renoprotection in patients with type 2 diabetic nephropathy:lessons from renal〔J〕.Kidney Int，2004;65(6):2309-20.