宋 軍 劉忠義 張平安 戴 晴

胡 潘2 魏歡歡2 楊 洋2

（湘潭大學(xué)食品與生物工程系，湖南 湘潭 411105）

草魚是中國(guó)淡水養(yǎng)殖魚類中產(chǎn)量最高的魚種，2010年，草魚產(chǎn)量達(dá)到422.22萬(wàn)t［1］。在魚類加工中，產(chǎn)生大量的包括魚頭、魚骨、魚鱗和內(nèi)臟等下腳料，其中魚內(nèi)臟的含量最大。怎樣有效利用魚類加工副產(chǎn)物，減輕環(huán)境污染，一直是人們積極探討的問(wèn)題。胡衛(wèi)強(qiáng)等［2］采用氣質(zhì)聯(lián)用法對(duì)草魚內(nèi)臟魚油脂肪酸組成進(jìn)行了測(cè)定，分析結(jié)果表明草魚內(nèi)臟魚油可用來(lái)制備生物柴油，還有人報(bào)道過(guò)使用稀堿加鉀鹽法或酶法從羅非魚內(nèi)臟中提取魚油［3，4］，以及酶解羅非魚蛋白制取多肽［5］。Aspmo等［6］報(bào)道過(guò)用酶解鱈魚內(nèi)臟得到的水解物作為微生物培養(yǎng)基的成分；Zhou等［7］采用5種商業(yè)蛋白酶水解鮑魚內(nèi)臟，測(cè)定了水解物的體外抗氧化性。然而，提取單一的部分有用物質(zhì)并不能充分利用魚內(nèi)臟，比較好的方法是同時(shí)從魚內(nèi)臟中獲得多種有用物質(zhì)，乃至最終全部利用魚內(nèi)臟，基本消除環(huán)境負(fù)荷。為了達(dá)成上述目的，本試驗(yàn)旨在以草魚內(nèi)臟為原料，通過(guò)熱水自溶法，運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化最優(yōu)水解條件，同時(shí)獲得魚油和具有抗氧化活性的水解物。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

新鮮草魚內(nèi)臟：收集于本地菜市場(chǎng)，清洗瀝干，勻漿后，20℃ 冷凍儲(chǔ)藏備用；

牛血清蛋白：北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；其他試劑：均為分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

紫外可見分光光度計(jì)：WFZ UV－2802SH型，上海尤尼柯儀器有限公司；

數(shù)顯水浴恒溫振蕩器：SHA－C型，常州國(guó)華電器有限公司；

高速離心機(jī)：LG10－2.4A型，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；

數(shù)顯pH計(jì)：PHS－3BW型，上海般特儀器制造有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 魚內(nèi)臟水解及魚油提取率的測(cè)定 冷凍的魚內(nèi)臟4℃下解凍，稱取100g原料于500mL的錐形瓶中，加入適量的蒸餾水，攪拌均勻，密封置于水浴搖床中恒溫振蕩，轉(zhuǎn)速為200r／min，一定時(shí)間后，趁熱4 000r／min離心10min，吸取上層油脂，水解液抽濾，制成干燥物備用，殘?jiān)^續(xù)處理。魚油用熱的飽和氯化鈉溶液洗2次，最后一次用熱水洗，分離出上層油，真空干燥得到粗魚油。魚油提取率按式（1）計(jì)算。

式中：

Y1—— 魚油提取率，%；

m1—— 提取粗魚油質(zhì)量，g；

m2—— 原料粗脂肪質(zhì)量，g。

1.2.2 RSM優(yōu)化熱水自溶法提油工藝條件 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取水解溫度、水解時(shí)間和加水量為自變量，提油率為響應(yīng)值，采用RSM中的BBD對(duì)熱水自溶法提油工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。利用SAS軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，根據(jù)該方案進(jìn)行試驗(yàn)并測(cè)定魚油提取率。單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：水解溫度考察試驗(yàn)設(shè)定水解時(shí)間60min，加水量60mL，考察溫度為50，55，60，65，70℃5個(gè)水平；水解時(shí)間考察試驗(yàn)設(shè)定水解溫度60℃，加水量60mL，考察時(shí)間為30，45，60，75，90min 5個(gè)水平；加水量考察試驗(yàn)設(shè)定水解溫度60℃，時(shí)間60min，考察加水量為40，60，80，100，120mL 5個(gè)水平。

將剩余殘?jiān)尤脒m量的蒸餾水勻漿成殘?jiān)?，料水比（m∶V）＝1∶4，然后加入2倍體積的石油醚，40℃萃取1h，離心分離出魚油。

1.2.3 油脂的理化指標(biāo)測(cè)定

（1）酸值：參照GB／T 5530——2005測(cè)定；

（2）過(guò)氧化值：參照GB／T 5538——2005測(cè)定；

（3）碘值：參照GB／T 5532——2008測(cè)定。

1.2.4 游離氨基氮測(cè)定 采用甲醛電位滴定法［8］。

1.2.5 水解液中多肽得率測(cè)定 參照文獻(xiàn)［9］的方法。以牛血清蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到牛血清蛋白濃度X與吸光度Y 之間的回歸方程為Y ＝0.006 76＋0.242 57 X，R2＝0.999 57。

1.2.6 羥自由基清除能力測(cè)定 參照文獻(xiàn)［10］的方法，并加以修改。取10mL水解液，加入等體積10%的三氯乙酸，4 000r／min離 心 10min。取 上 清 液 2mL 依 次 加 入9mmol／L水楊酸乙醇溶液2mL、9mmol／L FeSO4溶液2mL，最后加2mL 8.8mmol／L H2O2啟動(dòng)反應(yīng)。37℃水浴0.5h后，以5%三氯乙酸為參比，在510nm處測(cè)定OD值?？紤]到樣品本身的吸光值，以9mmol／L水楊酸乙醇溶液2mL、9mmol／L FeSO4溶液2mL、上清液2mL和蒸餾水2mL作為樣品的本底吸收值，所有測(cè)定值均為3次平均值。清除率按式（2）計(jì)算。

式中：

I—— 清除率，%；

A0——空白對(duì)照液的吸光度；

AX——加入待測(cè)液后的吸光度；

AX0——待測(cè)溶液的本底吸收值。

1.2.7 還原能力測(cè)定 參照文獻(xiàn)［7］的方法，略有修改。取水解液1.0mL依次加入1.0mL 0.2mol／L磷酸緩沖液（pH 6.6）和1.0mL 1%鐵氰化鉀，置于50 ℃水浴中反應(yīng)20min后急速冷卻，加入1.0mL 10%三氯乙酸，混合后以4 000r／min離心10min。取上清液2.0mL，加入2.0mL蒸餾水和0.4mL 0.1%氯化鐵，混勻，靜置10min后于700nm測(cè)定其吸光值。所有測(cè)定值均為3次平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚內(nèi)臟熱水自溶水解工藝參數(shù)的單因素試驗(yàn)

內(nèi)臟勻漿程度、pH值、水解溫度、水解時(shí)間以及加水量（或者料水比）等很多因素會(huì)影響魚內(nèi)臟的自溶和水解。內(nèi)臟勻漿能充分破壞內(nèi)臟的組織結(jié)構(gòu)，有利于內(nèi)臟的自溶過(guò)程能盡快順利完成，然而過(guò)度勻漿也可能導(dǎo)致內(nèi)臟勻漿物黏度太大，動(dòng)力消耗急劇增加。pH值會(huì)影響酶的活性，一般來(lái)說(shuō)，應(yīng)該是非常重要的影響因素。但是，在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)高的或者低的pH值會(huì)導(dǎo)致魚油皂化或者酸值增加，而對(duì)魚油提取率的影響并不大，因此草魚內(nèi)臟自溶水解時(shí)采用內(nèi)臟勻漿液的自然pH值（pH 6.2～6.4）。經(jīng)過(guò)初步篩選后，選擇水解溫度、水解時(shí)間以及加水量3個(gè)因素做進(jìn)一步的研究。

2.1.1 水解溫度對(duì)提油率的影響 由圖1可知，當(dāng)水解溫度為50～60℃時(shí)，隨著溫度的升高魚油提取率迅速增加，這可能是因?yàn)闇囟壬呒哟蟮鞍踪|(zhì)變性以及內(nèi)源酶對(duì)蛋白質(zhì)的水解，利于原料中油脂的釋放，溫度為60℃魚油提取率達(dá)到最大值，隨后魚油提取率隨著溫度升高而降低。而游離氨基氮含量在50～55℃逐漸增加，55℃達(dá)到較大值，繼續(xù)增加溫度，游離氨基氮含量減小，這可能與草魚內(nèi)臟內(nèi)源酶失活有關(guān)。由于魚油特別容易氧化，必須盡可能多的將內(nèi)臟中魚油提取出來(lái)，因此以魚油提取率為主要考量，結(jié)合水解液中游離氨基氮的變化，選擇60℃為較優(yōu)的提取溫度。

2.1.2 水解時(shí)間對(duì)提油率的影響 由圖2可知，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)魚油提取率逐漸增加，當(dāng)水解時(shí)間為60min時(shí)魚油提取率增加不明顯，水解液中游離氨基氮含量也趨緩。綜合考慮，75min可能為較佳的水解時(shí)間。

2.1.3 加水量對(duì)提油率的影響 由圖3可知，魚油提取率隨著加水量的增加而增加，加水量為60mL時(shí)達(dá)到較大值，加水量繼續(xù)增加，提取率逐漸降低。綜合考慮，選擇60mL為合適加水量。

圖1 水解溫度對(duì)提油率和游離氨基酸的影響Figure 1 Effects of temperature on fish oil extraction and free amino nitrogen

圖2 提取時(shí)間對(duì)魚油提取和游離氨基氮的影響Figure 2 Effects of extraction time on fish oil extraction and free amino nitrogen

圖3 加水量對(duì)魚油提取和游離氨基氮的影響Figure 3 Effects of water addition on fish oil extraction and free amino nitrogen

2.2 水解工藝參數(shù)的響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1 因素水平的選取及試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)Box－Beknhen中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取水解溫度、水解時(shí)間與加水量3個(gè)因素，以提油率為響應(yīng)值 （Y1）。 因子編碼及各自變量水平見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

2.2.2 回歸模型的建立及方差分析 運(yùn)用SAS軟件對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析，經(jīng)擬合得到二次多項(xiàng)回歸方程：Y1＝62.903 33 ＋10.522 5 X1＋13.697 5 X2－ 9.572 5 X3－5.461 667 X21－10.915 X1X2＋3.52 X1X3－8.771 66 X22－0.72 X2X3－7.806 667 X23，回歸分析結(jié)果見表3。由表3可知，R2＝98.67%，Ra2dj＝96.29%，表明因變量與自變量之間的線性關(guān)系良好，模型的P值遠(yuǎn)小于0.01，模型顯著，失擬項(xiàng)在α＝0.05水平上不顯著（P＝0.124 3＞0.05），表明各因素值和響應(yīng)值間的關(guān)系可以用此模型函數(shù)化，對(duì)響應(yīng)值作用顯著的有 X1、X2、X3、X21、X22、X23、X1X2，對(duì)提油率影響的因素依次是水解時(shí)間、水解溫度和加水量，即水解時(shí)間對(duì)提油率影響最明顯。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平Table 1 Analytical factors and levers for RSA

表2 Box－Beknhen中心組合試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental designs and results of oil extraction

模型的響應(yīng)面圖見圖4。由圖4（a）可知，水解時(shí)間和溫度的交互作用顯著，圖4結(jié)果和表3數(shù)據(jù)分析結(jié)果吻合。由圖4（b）可知，在選定的范圍內(nèi)保持X1（水解溫度）定值時(shí)，隨著X3（加水量）的增加提油率先增大后減少，同樣保持X3為定值時(shí)，隨著X1的增加開始階段提油率迅速增加，隨后趨緩。與回歸分析結(jié)果相符，水解溫度和加水量的交互作用不顯著。由圖4（c）可知，水解時(shí)間和加水量的交互影響不顯著，與統(tǒng)計(jì)結(jié)果相符。

為進(jìn)一步驗(yàn)證最佳點(diǎn)的值，將所得回歸方程分別對(duì)各自變量取一階偏導(dǎo)等于零可得一個(gè)三元一次方程組：

表3 回歸分析結(jié)果Table 3 Results of regression analysis

解之得X1＝0.186，X2＝0.925，X3＝ －0.698

代入變換公式即得水解溫度為59℃，水解時(shí)間為74min，加水量為56mL，該提取條件下，由回歸方程預(yù)測(cè)提油率的理論值為71.60%。在該條件下進(jìn)行3平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到的結(jié)果為平均提油率68.34%，標(biāo)準(zhǔn)差±0.89%。驗(yàn)證值與預(yù)測(cè)值較為吻合，說(shuō)明該模型的擬合程度較好。

2.3 魚油的理化性質(zhì)

魚油的酸值、過(guò)氧化值和碘值見表4。因測(cè)定殘?jiān)椭枯^高，故對(duì)殘?jiān)兔演腿∮椭?。由?可知，只需對(duì)粗魚油適當(dāng)精制，魚油理化性質(zhì)就能達(dá)到中國(guó)二級(jí)粗魚油國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

表4 油脂的理化性質(zhì)Table 4 Physical and chemical properties of fish oils

2.4 水解物的抗氧化活性測(cè)定

測(cè)定最優(yōu)工藝條件下水解液的抗氧化活性，并以未發(fā)生熱水自溶水解的勻漿液比較。由表5可知，勻漿液表現(xiàn)出一定的抗氧化活性，這可能與魚類蛋白源中促氧化劑［11］（包括亞鐵血紅素蛋白和磷脂）的存在有關(guān)。較之勻漿液，每10mg干物質(zhì)的水解液羥自由基清除率增加，達(dá)到（18.68±1.80）%。

圖4 各因素交互影響的響應(yīng)面圖Figure 4 Response surface plot on interactive effects of various factors

表5 水解物的抗氧化活性?Table 5 Antioxidant activity of hydrolysate

試驗(yàn)測(cè)定，草魚內(nèi)臟和水解液粗脂肪含量分別為734.54，14.38mg／g干物質(zhì)。絕大部分魚油被抽提出來(lái)，剩余魚油一部分存在于殘?jiān)娜闋钜?、另一部分為與蛋白質(zhì)結(jié)合的油脂，故分離水解液后的剩余殘?jiān)俳?jīng)過(guò)簡(jiǎn)單處理，也可以干燥后制作成飼料。

3 結(jié)論

利用RSM優(yōu)化熱水自溶法水解提油條件為水解溫度59℃，水解時(shí)間74min，加水量56mL，在該條件下試驗(yàn)測(cè)定值為（68.34±0.89）%，與預(yù)測(cè)值（71.60%）較吻合。通過(guò)熱水自溶，可以從魚內(nèi)臟中獲取魚油和具有抗氧化活性的水解液，剩余殘?jiān)部梢灾谱鞒娠暳稀?/p>

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