鹿連明，杜丹超，胡秀榮，蒲占湑，張小亞，陳國(guó)慶

(浙江省柑桔研究所，浙江臺(tái)州 318026)

柑橘木虱 (Diaphorina citri)屬同翅目木虱科，是柑橘、檸檬、黃皮、九里香、枸杞等蕓香科植物新梢期的主要害蟲(chóng)，也是傳播柑橘黃龍病的唯一自然蟲(chóng)媒。柑橘黃龍病作為當(dāng)前柑橘生產(chǎn)上防治最難、威脅最大的一種毀滅性病害，對(duì)柑橘產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定和發(fā)展帶來(lái)了嚴(yán)重威脅。但目前對(duì)該病害尚未獲得有效的防治藥劑，以防治柑橘木虱為主的綜合防治是當(dāng)前該病害防控的主要辦法。因此，加強(qiáng)對(duì)柑橘木虱的防治，無(wú)論對(duì)于控制柑橘黃龍病的流行還是降低蟲(chóng)體本身對(duì)柑橘的危害都具有重要意義。

目前對(duì)柑橘木虱的防治多采用化學(xué)防治措施，由此造成了農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染、生物多樣性破壞和柑橘木虱抗藥性等諸多問(wèn)題，而生物農(nóng)藥以其高效、低毒、低殘留、無(wú)污染、不易產(chǎn)生抗藥性和原料易得等特性被認(rèn)為是未來(lái)化學(xué)農(nóng)藥的理想替代藥劑。國(guó)內(nèi)外研究者在利用植物提取物、昆蟲(chóng)天敵和生防菌等防治柑橘木虱方面進(jìn)行了諸多有益的嘗試［1］，但研究多處于實(shí)驗(yàn)室階段，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中利用生防菌制劑成功防治的實(shí)例尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，柑橘木虱蟲(chóng)生真菌的進(jìn)一步分離篩選和生物潛能的研究，對(duì)于促進(jìn)將來(lái)柑橘木虱生物防治的順利開(kāi)展具有重要的意義。本研究通過(guò)采集柑橘木虱蟲(chóng)體，并從中分離出病原菌，以期篩選出對(duì)柑橘木虱具有較強(qiáng)致病力的菌株，以豐富現(xiàn)有的柑橘木虱蟲(chóng)生真菌資源，為將來(lái)柑橘木虱生防菌的開(kāi)發(fā)利用提供材料。

1 材料與方法

1.1 供試蟲(chóng)源

分離病原菌所用的柑橘木虱蟲(chóng)體采集于浙江省臺(tái)州市黃巖區(qū)不同柑橘園內(nèi);測(cè)定病原菌的致病性所用的健康柑橘木虱成蟲(chóng)為浙江省柑橘研究所溫室中九里香植株上常年繼代飼養(yǎng)的種群。

1.2 試劑和培養(yǎng)基

dNTP、r－Taq酶等 PCR相關(guān)試劑，TaKaRa公司;CTAB、巰基乙醇、異丙醇，Amersco公司;核酸染料GelRed，Biotium公司;凝膠回收試劑盒，Axygen公司。其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

用于病原真菌分離培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂 (PDA)培養(yǎng)基。稱(chēng)取200 g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水1 000 mL煮沸0.5 h，紗布過(guò)濾，再加20 g葡萄糖和20 g瓊脂，充分溶解后用熱紗布過(guò)濾，分裝至錐形瓶或玻璃試管中，121℃，高壓滅菌20 min。

1.3 引物

所用引物為擴(kuò)增真菌ITS區(qū)域的通用引物ITS5(5'－GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG－3') 和 ITS4(5'－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3')，由上海 Invitrogen公司合成。

1.4 病菌的分離純化

將田間采集的柑橘木虱置于無(wú)菌離心管中帶回實(shí)驗(yàn)室，對(duì)蟲(chóng)體表面已有肉眼可見(jiàn)菌絲體的柑橘木虱蟲(chóng)尸，直接放于PDA培養(yǎng)基中;對(duì)柑橘木虱活蟲(chóng)或表面無(wú)菌絲的蟲(chóng)尸，先置于70%乙醇中浸泡30 s，再經(jīng)0.1%升汞浸泡3 min后，用無(wú)菌水沖洗3次，用無(wú)菌濾紙吸干蟲(chóng)體上的水分，再置于PDA培養(yǎng)基中。隨后將各載有蟲(chóng)體的培養(yǎng)基置于28℃微生物培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，至蟲(chóng)體周?chē)L(zhǎng)出菌絲后，挑取菌絲轉(zhuǎn)至新的PDA平板上培養(yǎng) (重復(fù)此操作2～3次)，待菌落上產(chǎn)生分生孢子，用無(wú)菌水洗脫分生孢子制備成分生孢子懸浮液，然后用稀釋純化法對(duì)病菌進(jìn)行單孢分離。最后將分離純化獲得的菌株保存于PDA斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3～4 d后，置于4℃冰箱保存。

1.5 致病菌的篩選

將上述分離純化保存的菌株接種到PDA平板上，于28℃恒溫培養(yǎng)10 d后，以無(wú)菌水洗脫菌落上產(chǎn)生的分生孢子，制備分生孢子懸浮液。以血球計(jì)數(shù)板確定孢子懸浮液的濃度，并向其中加入適量的吐溫80至終濃度為0.1%。取溫室飼養(yǎng)的健康柑橘木虱成蟲(chóng)浸沒(méi)于含0.1%吐溫80的分生孢子懸浮液中10～15 s，挑取處理后仍能自由活動(dòng)的柑橘木虱置于培養(yǎng)皿中的九里香葉片上 (培養(yǎng)皿底部鋪有2層用無(wú)菌水濕潤(rùn)過(guò)的濾紙，其上放置一個(gè)帶有10個(gè)左右葉片的九里香嫩枝，枝條底端以無(wú)菌水濕潤(rùn)的脫脂棉包裹)，然后放于28℃光照培養(yǎng)箱中 (每天14 h光照/10 h黑暗，濕度95%以上)培養(yǎng)。上述每處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)為30頭柑橘木虱;同時(shí)設(shè)含0.1%吐溫80的無(wú)菌水處理柑橘木虱為對(duì)照。于體視顯微鏡下觀察病菌對(duì)柑橘木虱的侵染和致死情況，記錄上述各處理的柑橘木虱的總蟲(chóng)數(shù)和死亡蟲(chóng)數(shù)，計(jì)算死亡率和校正死亡率。

通過(guò)上述方法，從處理后的柑橘木虱蟲(chóng)體中分離病菌，比較再分離的病菌與初始接種病菌的形態(tài)特征和培養(yǎng)特征，篩選出符合科赫氏法則的對(duì)柑橘木虱具致病性的菌株，排除從柑橘木虱蟲(chóng)體上分離到的腐生菌等非致病菌。

1.6 菌株GJMS032培養(yǎng)特征和形態(tài)特征

將上述分離純化的菌株GJMS032接種到PDA培養(yǎng)基平板中央，置于28℃恒溫培養(yǎng)，每日觀察菌落生長(zhǎng)情況，并記錄菌落顏色和形態(tài)。將菌株GJMS032接種到另一PDA培養(yǎng)基平板中央，同時(shí)將滅菌后的蓋玻片 (1 cm×1 cm)斜插入距接種點(diǎn)約1 cm處的培養(yǎng)基內(nèi)，置于28℃恒溫培養(yǎng)約5 d，待菌絲爬到蓋玻片上后，取出蓋玻片置于光學(xué)顯微鏡下觀察菌株GJMS032的菌絲和孢子形態(tài)。

1.7 菌株GJMS032的序列分析

1.7.1 總DNA的提取

將菌株GJMS032接種至PDA培養(yǎng)基平板，置于28℃恒溫培養(yǎng)至菌落長(zhǎng)滿(mǎn)整個(gè)培養(yǎng)皿，以無(wú)菌藥匙刮取平板上生長(zhǎng)的真菌菌絲于無(wú)菌研缽中，加入液氮研磨至粉末狀，采用改良的CTAB法提取菌株GJMS032的總DNA。具體方法為:加入1 mL預(yù)熱的2%的CTAB緩沖液及10～20 μL β－巰基乙醇，轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，于65℃水浴30～60 min;加入酚/氯仿/異戊醇 (25∶24∶1)抽提1～2次;再用氯仿/異戊醇 (24∶1)抽提1次;取上清，加入預(yù)冷的異丙醇，－20℃放置30～60 min以沉淀DNA;適量75%乙醇洗滌沉淀2次;沉淀于室溫下自然晾干，然后于10～20 μL TE(含RNase 50 mg·L－1)中溶解，所得溶液即為樣品DNA溶液。取1 μL溶液上樣于0.8%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，檢測(cè)所提取的DNA質(zhì)量。

1.7.2 PCR擴(kuò)增

以提取純化的DNA為模板，以通用引物ITS5和ITS4 擴(kuò)增菌株 GJMS032 的 ITS1－5.8S rDNA－ITS2基因。PCR反應(yīng)體系為:10×Buffer 2.5 μL，dNTPs 2 μL，上下游引物 (10 μmol·L－1)各 1.5 μL，r－TaqDNA聚合酶0.2 μL，DNA模板1 μL，無(wú)菌水補(bǔ)足至總體積25 μL。反應(yīng)條件為94℃ 5 min，94℃1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)，72℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳觀察拍照。

1.7.3 測(cè)序及序列分析

于瓊脂糖凝膠上割取PCR產(chǎn)物的目的條帶，利用Axygen膠回收試劑盒回收純化，然后送交至Invitrogen公司利用引物ITS5/ITS4進(jìn)行兩端測(cè)序。利用NCBI Blast對(duì)所測(cè)序列進(jìn)行比對(duì)分析，查看其與GenBank中已知物種對(duì)應(yīng)序列的相似性。選取GenBank中與之同源性較高的一些菌種的序列，利用Clustal X進(jìn)行多重比對(duì)后，使用MEGA 5.05軟件，通過(guò)Neighbor joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，在構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)時(shí)進(jìn)行自舉檢驗(yàn)，重復(fù)抽樣1 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株GJMS032的致病性

通過(guò)篩選獲得1株對(duì)柑橘木虱具有致病力的菌株，命名為 GJMS032。以1.0×109spores·mL－1菌株分生孢子懸浮液處理柑橘木虱后3 d，校正死亡率為38.5%;處理后7 d，校正死亡率達(dá)98%。處理后第2天，通過(guò)體視顯微鏡，即可在一些蟲(chóng)體表面觀察到菌絲長(zhǎng)出，至7 d后，肉眼可見(jiàn)菌株GJMS032的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu) (圖1)。

圖1 菌株GJMS032對(duì)柑橘木虱的侵染

2.2 菌株GJMS032的培養(yǎng)特征和形態(tài)特征

菌株GJMS032在PDA培養(yǎng)基上于25℃恒溫培養(yǎng)7 d，其菌落直徑可達(dá)5 cm，具同心環(huán)紋。菌絲體為白色，分生孢子呈赭黃色，質(zhì)地絲絨狀，具少量無(wú)色滲出液，菌落反面為黃褐色。

光學(xué)顯微鏡下觀察菌株的分生孢子頭呈球形，分生孢子梗直立，孢梗莖長(zhǎng)650～1 600 μm，寬10～15 μm，莖壁粗糙，頂囊球形或近球形，直徑25～45 μm，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)雙層，?；笮?～7 μm×2.5～4 μm，瓶梗大小為8 ～12 μm ×3 ～4 μm;分生孢子為球形或近球形，直徑2.5～3.5 μm(圖2)。

圖2 菌株GJMS032在光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)特征

2.3 菌株GJMS032的序列分析

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，通用引物ITS5/ITS4擴(kuò)增菌株GJMS032的PCR產(chǎn)物大小為610 bp左右。測(cè)序后選取其中的ITS1－5.8S rDNA－ITS2基因區(qū)域，利用NCBI Blast進(jìn)行在線比對(duì)。分析發(fā)現(xiàn)，所測(cè)序列與GenBank中Aspergillus westerdijkiae和A．ochraceus多個(gè)分離物的序列相似性達(dá)98% ～100%。

在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中 (圖3)，菌株GJMS032與A．westerdijkiae，包括模式菌株 NRRL3174(GenBank NO.EF661427)在內(nèi)的多個(gè)分離物及A．ochraceus的幾個(gè)分離物聚為1個(gè)分支，而A．ochraceus的模式菌株 (GenBank No.AY373856)及其他幾個(gè)分離物和曲霉屬其他幾個(gè)種的菌株聚為另外1個(gè)分支?；谏鲜鲫P(guān)于形態(tài)特征和培養(yǎng)特征的描述及對(duì)ITS1－5.8S rDNA－ITS2 序列的 分析，可 將 菌 株GJMS032初步鑒定為A．westerdijkiae。

圖3 基于ITS1－5.8S rDNA－ITS2基因構(gòu)建的菌株GJMS032系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 小結(jié)與討論

目前已報(bào)道的對(duì)柑橘木虱具有致病作用的真菌有擬青霉屬的宛氏擬青霉 (Paecilomyces varioti)和玫煙色擬青霉 (P．fumosoroseus)、白僵菌屬的球孢白僵菌 (Beauveria bassiana)、綠僵菌屬的金龜子綠僵菌 (Metarhizium anisopliae)、被毛孢屬的檬形被毛孢 (Hirsutella citriformis)、筍頂孢屬的蚜筍頂孢霉 (Acrostalagmus aphidium)、鐮孢屬的黃色鐮刀菌 (Fusarium culmorum)、輪枝孢屬的蠟蚧輪枝菌 (Lecanicillium lecanii)、枝孢屬的尖孢枝孢菌(Cladosporiumoxysporum)及柑橘煤炱菌(Capnodium citri)、匍柄霉 (Stemphyliumsp.)等［2－3］。對(duì)于曲霉屬真菌侵染柑橘木虱的研究報(bào)道較少。上世紀(jì)80年代，陳祝安等［2］從田間發(fā)病的柑橘木虱蟲(chóng)體上分離到了日本曲霉 (A．japonica)，但未對(duì)其致病性進(jìn)行驗(yàn)證。

根據(jù)培養(yǎng)特征、形態(tài)特征及ITS1－5.8S rDNAITS2序列，可將所分離的菌株GJMS032鑒定為曲霉屬的一種真菌。但其ITS1－5.8S rDNA－ITS2序列與 GenBank中曲霉屬的A．westerdijkiae和A．ochraceus的多個(gè)分離物均具有較高的同源性，難以鑒定其具體為哪一個(gè)種。通過(guò)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，A．westerdijkiae是近年來(lái)從A．ochraceus新分離出來(lái)的一個(gè)種，原來(lái)A．ochraceus的一些分離物現(xiàn)已被重新鑒定為A．westerdijkiae。2個(gè)菌種的形態(tài)特征具有高度的相似性，但可通過(guò) ITS1－5.8S rDNA－ITS2和 β－tubulin 基因序列區(qū)分開(kāi)來(lái)［4－8］。在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上，菌株GJMS032與A．westerdijkiae的模式種聚為一個(gè)分支，其中也含有多個(gè)A．ochraceus的分離物，推測(cè)認(rèn)為這些A．ochraceus分離物可能未得到重新鑒定更新而沿用了以前的名稱(chēng)，實(shí)際可能是A．westerdijkiae。而A．ochraceus的模式種和其他多個(gè)分離物處于另外一個(gè)分支中?；谝陨戏治?，將菌株初步鑒定為A．westerdijkiae。

曲霉屬真菌種類(lèi)繁多，在世界范圍內(nèi)廣泛分布。其中作為蟲(chóng)生真菌報(bào)道過(guò)的種類(lèi)有A．flavus、A．parasiticus、A．oryzae、A．tamarii、A．ochraceus、A．niger和A．candidus等［9］。如 Kodaira 等［10］從A．ochraceus侵染的家蠶幼蟲(chóng)的血液中提取的物質(zhì)注入健康家蠶的體腔中能致死家蠶，從而表明毒素的存在;Robert等［11］研究發(fā)現(xiàn)，A．ochraceus在昆蟲(chóng)體內(nèi)可產(chǎn)生赭曲霉素，通過(guò)體腔注射美國(guó)白蛾可使其麻痹死亡。Vega等［12］發(fā)現(xiàn)，A．westerdijkiae可侵染咖啡果小蠹的寄生蜂Prorops nasuta，并可產(chǎn)生赭曲霉素A。本研究所分離的菌株GJMS032，初步鑒定為A．westerdijkiae，對(duì)柑橘木虱具有較強(qiáng)的致病作用。遺憾的是，曲霉屬真菌通常會(huì)產(chǎn)生多種對(duì)人和動(dòng)物有害的毒素，如赭曲霉毒素通常對(duì)腎有危害及對(duì)免疫系統(tǒng)有毒性［13］，因此難以在植物病蟲(chóng)害的生物防治中推廣應(yīng)用。

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