郭靜雯，張忠山，王曉梅，韓志萍，張易祥

(1.湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江湖州 313000;2.福建省化學(xué)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門 361000)

近年來，人們?yōu)榱酥卫砀粻I養(yǎng)化水域，利用高等水生植物與藻類的相互作用現(xiàn)象達(dá)到目的。目前已有較多植物的抑藻成分得到提取和鑒定，并在水域生態(tài)保護(hù)上起到重要作用［1－3］。本文報(bào)道了蘆竹提取物對藍(lán)藻 (藍(lán)藻)的抑制作用，并從中提取分離出抑藻活性物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料

蘆竹采于浙江省湖州師范學(xué)院德清湖岸，清洗干凈，烘干備用。銅綠微囊藻由生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞研究所獲得，實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)大培養(yǎng)后用于試驗(yàn)。

試劑乙醇、苯酚、葡萄糖等，除特殊說明外，均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蘆竹組織提取液的制備

稱取100 g干蘆竹植株 (粉碎至0.3 mm)，置于三口燒瓶中，加入10倍蒸餾水于80℃提取3 h，提取液濃縮至100～200 mL，加入4倍體積無水乙醇。過濾，將上清液濃縮凍干，同時(shí)收集沉淀。分別記錄醇溶物和水溶物，并各溶于水配制成10%濃度備用。

1.2.2 總糖含量的測定

準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖50 mg于100 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻。分別吸取0.05，0.10，0.15，0.20，0.25和0.30 mL各補(bǔ)蒸餾水至2.0 mL，然后加入1 mL 5%苯酚后快速加入濃硫酸5.0 mL。迅速搖勻，室溫靜置30 min后，于490 nm處測吸光度D。以2.0 mL蒸餾水作為空白組按照上述同樣操作步驟進(jìn)行。以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)來繪制標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖曲線。

分別取樣品溶液適量補(bǔ)蒸餾水至2.0 mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟測定各濃度下的吸光度，并計(jì)算樣品中的總糖含量。

1.2.3 樣品分子量的測定

樣品分子量測定采用高效液相色譜法進(jìn)行，色譜柱為TSK G3000(300 mm×7.8 mm)，柱溫為40℃。將樣品配成2%的硫酸鈉溶液上樣分析，2.84%的硫酸鈉溶液洗脫，流速為0.5 mL·min－1，示差檢測器檢測。標(biāo)準(zhǔn)多糖采用一系列的不同分子量的右旋多糖酐，其分子量為2 500～2 000 000 u。

1.2.4 樣品抑藻活性試驗(yàn)

將樣品分別配成濃度為0.01%，0.05%，0.50%和5.00%的水溶液，加入到裝有BG-11培養(yǎng)基 (預(yù)先高溫高壓滅菌)的培養(yǎng)瓶中，每瓶接種入3 mL處于對數(shù)生長期的銅綠微囊藻細(xì)胞懸液。以蒸餾水為對照，每處理設(shè)2個(gè)重復(fù)。接種后置專用培養(yǎng)架上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25℃，光照強(qiáng)度為2 000 lx，光暗周期比為12 h∶12 h。

1.2.5 藍(lán)藻生長量的測定

分別于接種后第0～19天，在665和649 nm兩個(gè)波長下測定藍(lán)藻吸光度 (D665和D649)，以D665的變化表示藍(lán)藻細(xì)胞的生長情況。

1.2.6 葉綠素a的測定

葉綠素a的含量用比色法測定。色素的濃度=13.95D665－6.88D649。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

采用WPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品提取液

將蘆竹葉提取液加入乙醇后，出現(xiàn)大量白色沉淀。上清液回收乙醇后冷凍干燥呈黃色，在空氣中暴露后迅速吸水呈現(xiàn)油狀，加水迅速溶解。兩者分別記錄為醇溶物和水溶物，但是均在水中可溶。

2.2 樣品總糖含量

采用苯酚－硫酸法測得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，當(dāng)濃度0.002～0.010 mg·mL－1時(shí)線性關(guān)系最好。線性回歸方程為y=49.624x－0.004 6(R2=0.999 9)。在試驗(yàn)條件下探索得取350 μL樣品溶液補(bǔ)蒸餾水至2.0 mL，分別測出的蘆竹葉上清液提取物和沉淀提取物的吸光度為最適吸光度。由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蘆竹葉醇溶物和水溶物中總糖含量分別為0.14%和54.30%。

2.3 樣品分子量

經(jīng)過高效凝膠色譜測定，醇溶物和水溶物的重均分子量分別為547和3 359 u。結(jié)合總糖含量測定結(jié)果，可得出水溶物應(yīng)為寡糖素類化合物。

2.4 蘆竹葉上清液提取物對藍(lán)藻生長的影響

圖1表明，0.01%和0.05%的蘆竹葉上清液提取物對藍(lán)藻有一定的促進(jìn)作用，且促進(jìn)作用呈顯著增大的趨勢。5.00%的蘆竹葉上清液提取物則起穩(wěn)定的抑制作用。而0.50%的蘆竹葉上清液提取物對藍(lán)藻生長的影響是復(fù)雜的。接種第0～15天有明顯的促進(jìn)作用，從第16天開始又顯示抑制作用，且抑制的程度大小也有波動(dòng)。

2.5 蘆竹葉沉淀提取物對藍(lán)藻生長的影響

觀察圖2可知，0.01%和0.05%的蘆竹葉沉淀提取物對藍(lán)藻生長有一定的促進(jìn)作用，且兩者的促進(jìn)程度相類似。在接種的第6～11天，0.50%的蘆竹葉沉淀提取物有小范圍的波動(dòng)，但大體上呈抑制作用。5.00%的蘆竹葉沉淀提取物則從第4天開始呈平穩(wěn)的抑制作用。

圖1 不同濃度上清液提取物吸光度隨時(shí)間的變化

圖2 不同濃度沉淀提取物的吸光度隨時(shí)間的變化

由圖3看出，葉綠素含量隨天數(shù)有明顯的變化，即反映的是接種藍(lán)藻的生長情況。與圖1對比，曲線呈類似的變化趨勢，可推斷藍(lán)藻出現(xiàn)不同的生長情況是因?yàn)樵谂囵B(yǎng)基內(nèi)加了蘆竹葉上清液提取物的緣故。而不同濃度上清液提取物對藍(lán)藻生長的影響是不同的，基本符合高濃度抑制和低濃度促進(jìn)的規(guī)律。對比圖2，4曲線，也能得到上述結(jié)論。

圖3 上清液提取物的葉綠素含量隨時(shí)間的變化

圖4 沉淀提取物的葉綠素含量隨時(shí)間的變化

3 小結(jié)和討論

近年來國內(nèi)外學(xué)者大多數(shù)利用植物種植水［2，4］和植物提取物［5－7］進(jìn)行藻類的化感作用研究。本研究表明，蘆竹植物器官組織不同物質(zhì)具有不同的抑藻效果。試驗(yàn)表明，蘆竹的水提取物中含有糖類物質(zhì)，初步推測為纖維寡糖，具有一定抑藻活性，其結(jié)構(gòu)有待于深入研究。蘆竹在江浙地區(qū)的水體岸邊具有較廣泛的分布，在富營養(yǎng)化水體中種植挺水植物蘆竹，不僅可吸收利用富營養(yǎng)化水體中的氮和磷，以及蘆竹釋放的抑藻化感物質(zhì)，還可直接抑制藍(lán)藻的生長。因此，本研究可為探索切實(shí)可行的富營養(yǎng)化水體的生態(tài)治理提供科學(xué)依據(jù)。

［1］陳建中，李利芳，張海洋，等．蘆竹和睡蓮對銅綠微囊藻的生長抑制效應(yīng) ［J］．環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2011，34(7):35－37.

［2］李磊，侯文華．荷花和睡蓮種植水對銅綠微囊藻生長的抑制作用研究［J］．環(huán)境科學(xué)，2007，28(10):2180－2186.

［3］戴樹桂，趙凡，金朝暉，等．香蒲植物提取物的抑藻作用及其分離鑒定［J］．環(huán)境化學(xué)，1997，16(3):268－271.

［4］陳衛(wèi)民，張清敏，戴樹桂．苦草與銅綠微囊藻的相互化感作用 ［J］．中國環(huán)境科學(xué)，2009，29(2):147－151.

［5］丁惠君，彭祺，張維昊，等．三種濕生植物對微囊藻的化感作用初步分析 ［J］．環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2007，30(4):6－10.

［6］馮菁，朱擎，吳為中，等．稻草浸泡液對藻類抑制作用機(jī)制 ［J］．環(huán)境科學(xué)，2008，29(12):3376－3381.

［7］洪喻，胡洪營，黃晶晶，等．不同溶劑提取蘆竹化感物質(zhì)對銅綠微囊藻生長的影響 ［J］．環(huán)境科學(xué)，2008，29(11):3143－3147.