郝夢(mèng)甄，胡志和，肖學(xué)勇

（天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津300134）

海參（Stichopus Japonicus）又名刺參、沙哩等，棘皮動(dòng)物門，海參綱，是重要的海洋無(wú)脊椎動(dòng)物，已有5000萬(wàn)年歷史，種類有1200多種。我國(guó)海參主要分布在黃海、渤海海域和廣東、廣西及海南沿海，主要經(jīng)濟(jì)品種分別為刺參和梅花參，其中刺參是我國(guó)品質(zhì)最好的海參種類之一[1]。研究證明，海參體壁中含有海參多糖、海參皂苷、海參膠原蛋白、海參腦苷酯、神經(jīng)節(jié)苷酯等多種生物活性物質(zhì)[2]，具有提高免疫功能、抗腫瘤、抗凝血、抗血栓、降血脂、抗衰老等多種生理功效[3－5]。目前海參的傳統(tǒng)加工方法主要是將鮮海參制作成干參或鹽漬參[6]，大量的活性成分在加工過(guò)程中流失，但鮮海參因其自溶酶的作用很難在常溫下保存，組織蛋白酶B（Cathepsin B，CB）是一種溶酶體半胱氨酸蛋白水解酶，對(duì)肌肉蛋白質(zhì)有廣泛的降解作用[7]。因此鮮海參保藏問(wèn)題亟需解決。超高壓技術(shù)（ultra high－pressure，UHP）是一種新型的非熱殺菌技術(shù)，起源于化工領(lǐng)域，能有效殺滅食品中的微生物[8－10]，保留有效功能成分和芳香物質(zhì)，并且在一定壓力范圍能有效抑制食品中的酶類[11－13]。由于酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，其生物活性與其三維結(jié)構(gòu)有關(guān)，酶的生物活性產(chǎn)生于活性中心，活性中心是由分子的三維結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的[14]。蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的改變與體積變化有關(guān)，而超高壓有利于體積減小的反應(yīng)發(fā)生，因此酶活會(huì)受到高壓的影響。每種酶都存在最低失活壓力，低于這個(gè)壓力酶就不會(huì)失活，在特定時(shí)間內(nèi)當(dāng)壓力超過(guò)這個(gè)值時(shí)酶失活速度會(huì)加速直到完全失活[15]。Ludikhuyze等[16-17]對(duì)超高壓下的動(dòng)力學(xué)研究得出，各類酶的超高壓滅活酶模型主要符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型（A=A0e-kt）。恒溫恒壓條件下K的獲得都采用Eyring理論和Arrhenius理論[18]。目前超高壓的應(yīng)用主要用于果蔬汁的冷殺菌以及肉類、水產(chǎn)的殺菌及保藏中，為了探索超高壓技術(shù)在鮮海參加工中的應(yīng)用，本實(shí)驗(yàn)研究了超高壓技術(shù)對(duì)從海參體壁中提取的粗酶酶活的影響，為鮮海參的超高壓加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮海參 購(gòu)于煙臺(tái)鮑參堂；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸銨（均為分析純） 天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；干酪素（化學(xué)純）天津市東方衛(wèi)生材料廠；氫氧化鈉、碳酸鈉（分析純）天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；三氯乙酸（分析純）天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；酪氨酸 美國(guó)Sigma公司；Folin-Phenol 喜潤(rùn)（上海）生化試劑有限公司。

HPP.L3-600/0.6超高壓生物處理機(jī) 天津市華泰森森生物工程技術(shù)有限公司；FA1104N電子天平上海精密科學(xué)儀器公司；JJ-2（2003-61）組織搗碎勻漿機(jī) 常州國(guó)華電器有限公司；sigma 3-18k離心機(jī)北京博勱行儀器有限公司；電熱恒溫水槽 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；VELP旋渦振蕩器 北京盈盛恒泰科技有限責(zé)任公司；TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Scientz-50N冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 海參體壁粗酶的提取 參考朱蓓薇[19]的研究方法稍作改進(jìn)，新鮮海參去內(nèi)臟后用去離子水沖洗干凈，經(jīng)組織搗碎勻漿機(jī)搗碎的海參肉25g加入0.1mol/L pH6.3的磷酸緩沖液（PBS）75mL浸提，即質(zhì)量體積比1∶3。4℃下靜置過(guò)夜后8000r/min離心10min，收集上清液，加入（NH4）2SO4至20%飽和度，4℃靜置4h，8000r/min離心10min。棄沉淀，上清液繼續(xù)加入至70%飽和度，4℃靜置4h，8000r/min離心10min。沉淀經(jīng)冷凍干燥后，4℃保存。

1.2.2 超高壓處理 取1g干酶粉末加入0.1mol/L的磷酸緩沖液（pH=6.3）6mL溶解，取粗酶液裝于真空密封袋中，真空密封后進(jìn)行超高壓處理，每組樣品做三次平行。單因素處理?xiàng)l件為：室溫（15℃）在壓力分別為0、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600MPa下處理10min；室溫下300MPa分別處理0、10、15、20、25、30、35、40min；分別在溫度15、20、30、40、45、50℃下300MPa處理10min。

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，因素及水平見(jiàn)表1。

表1 超高壓抑制海參體壁粗酶的正交實(shí)驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels for orthogonal test of the inhibiting enzyme from Stichopus Japonicus body wall with UHP

通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)獲得超高壓抑制海參體壁粗酶酶活的最優(yōu)處理?xiàng)l件后，在此條件下對(duì)鮮海參進(jìn)行超高壓處理，并按照方法1.2.3進(jìn)行粗酶提取后進(jìn)行酶活測(cè)定。

1.2.3 酶活測(cè)定 按照SB/T10317-1999蛋白酶活力測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)為660nm。粗酶活力按式（1）計(jì)算。

式中：C為根據(jù)樣品測(cè)得OD值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線得相當(dāng)?shù)睦野彼嵛⒖藬?shù)；4為4mL反應(yīng)液取出1mL測(cè)定（即4倍）；N為酶液稀釋的倍數(shù)（6倍）；10為反應(yīng)10min；W為樣品水分百分含量（0%）。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)配制酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液后在660nm下進(jìn)行吸光值測(cè)定，以未處理樣品的酶活力為100%，處理后樣品的酶活力與未處理樣品酶活力的比值為酶活殘存率，按式（2）計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定結(jié)果如圖1所示。

圖1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of tyrosine solution

由圖1可知，酪氨酸濃度增大，光密度增加，并呈線性關(guān)系，通過(guò)線性回歸分析可得回歸方程：y=0.0132x+0.0227，R2=0.9978。

2.2 超高壓處理對(duì)海參體壁粗酶活性的影響

2.2.1 超高壓處理壓力對(duì)海參體壁粗酶活性的影響

壓力大小對(duì)海參體壁粗酶活性的影響結(jié)果如圖2所示。

圖2 15℃下不同壓力處理10min對(duì)海參體壁粗酶活性的影響Fig.2 Effect of different pressure treatment on the enzyme activity of Stichopus Japonicus body wall for 10min at 15℃

由圖2可以看出，在較低壓力范圍內(nèi)，隨著壓力的升高，海參體壁粗酶的酶活逐漸升高，250MPa處理時(shí)，酶活殘存率最高為100.78%，未處理的鮮海參體壁粗酶酶活為100.6U，250MPa下處理后酶活為101.38U，這與夏遠(yuǎn)景[20]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果有差異，可能與實(shí)驗(yàn)材料本身特性有關(guān)。250MPa時(shí)的酶活殘存率大于100%，說(shuō)明超高壓改變了海參體壁粗酶的原有結(jié)構(gòu)，使其更易與底物酪蛋白反應(yīng)。隨著壓力逐漸升高，海參體壁粗酶的酶活逐漸降低，酶活受到明顯抑制，600MPa時(shí)，酶活為24.37U，酶活殘存率最低為24.22%，說(shuō)明超高壓處理能夠有效抑制海參體壁粗酶的酶活力。

2.2.2 超高壓處理時(shí)間對(duì)海參體壁粗酶活性的影響

處理時(shí)間對(duì)海參體壁粗酶活性的影響的結(jié)果如圖3所示。

圖3 15℃下300MPa處理不同時(shí)間對(duì)海參體壁粗酶活性的影響Fig.3 Effect of different pressure treating time with 300 MPa at 15℃on the enzyme activity of the Stichopus Japonicus body wall

從圖3可以看出，常溫下隨著超高壓處理時(shí)間的延長(zhǎng)，海參粗酶酶活先降后升再降，在處理15min時(shí)，酶活殘存率存在最大值，為77.02%；15min后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活逐漸受到抑制而降低，超高壓處理40min時(shí)，酶活殘存率最低，為36.76%。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，海參體壁粗酶酶活將會(huì)受到有效抑制。

2.2.3 超高壓處理溫度對(duì)海參體壁粗酶活性的影響

處理溫度對(duì)海參體壁粗酶活性的影響的結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同溫度下300MPa處理10min對(duì)海參體壁粗酶活性的影響Fig.4 Effect of different temperature with 300MPa for 10min on the enzyme activity of the Stichopus Japonicus body wall

由圖4可以明顯看出，超高壓處理在一定溫度范圍內(nèi)，海參體壁粗酶酶活殘存率有升高的趨勢(shì)，在海參體壁粗酶反應(yīng)最適溫度40℃時(shí)，酶活殘存率最高為83.45%；溫度高于40℃后，隨著溫度的升高，海參體壁粗酶酶活明顯降低，50℃時(shí)最低為52.42%；說(shuō)明在溫度高于40℃時(shí)，升高超高壓處理的溫度能夠有效抑制海參體壁粗酶酶活力。

2.2.4 超高壓處理對(duì)海參體壁粗酶活性的正交分析結(jié)果 由表3對(duì)超高壓處理海參體壁粗酶的正交實(shí)驗(yàn)方差分析可以看出，超高壓處理的壓力、時(shí)間和溫度三因素均對(duì)粗酶殘存率影響顯著，結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)的極差分析可以得出，在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的條件范圍內(nèi)，使酶活殘存率最低的條件即超高壓處理的最優(yōu)條件壓力為600MPa、時(shí)間為35min、溫度為45℃。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證在該條件下處理的海參體壁粗酶酶活殘存率為19.11%，結(jié)果優(yōu)于表2中的數(shù)值。

表2 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental design and results for L9（34）orthogonal test

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 3 Variance analysis for orthogonal array experimental results

2.2.5 超高壓處理對(duì)鮮海參中粗酶的影響 在45℃下，600MPa處理35min條件下，利用超高壓直接處理鮮海參后進(jìn)行體壁粗酶提取并測(cè)定酶活，酶活殘存率為28.43%，結(jié)果比驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中超高壓直接作用于粗酶液的殘存率值19.11%高，說(shuō)明海參體壁組織對(duì)其中的粗酶有保護(hù)作用。

3 討論與結(jié)論

目前，對(duì)海參體壁中粗酶組成成分的研究不是很深入，杜英等[21]從海參腸及海參體壁中提取了海參乙酰膽堿酯酶粗酶并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其最適反應(yīng)pH為8.0，最適反應(yīng)溫度為35℃左右，與海參自溶的一種重要的酶是海參體壁組織蛋白酶B。Turk等[22]研究發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶B是能直接或間接地激活細(xì)胞凋亡的主要蛋白酶，與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。趙露露等[23]已從海參體壁中提取了海參體壁組織蛋白酶B，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其最適反應(yīng)pH為5.5，最適反應(yīng)溫度為40℃。以上兩種酶的最適反應(yīng)pH及最適反應(yīng)溫度與本實(shí)驗(yàn)的粗酶系有所差距，說(shuō)明酶單獨(dú)作用與綜合作用條件不一致。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究可知，在較高的處理?xiàng)l件下超高壓對(duì)海參體壁粗酶酶活抑制效果明顯，并通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)獲得超高壓處理抑制海參體壁粗酶酶活的最優(yōu)條件為壓力600MPa，時(shí)間35min，溫度45℃，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證海參體壁粗酶酶活殘存率結(jié)果為19.11%，并且在此條件下測(cè)得超高壓直接作用鮮海參的體壁粗酶酶活殘存率也僅為28.43%，充分說(shuō)明了超高壓處理能夠有效抑制酶活力，這為超高壓處理在海產(chǎn)品中廣泛應(yīng)用提供了一定理論依據(jù)。

[1]李銀塔，李鈺金，陳英鄉(xiāng)，等.即食鮮海參生產(chǎn)工藝研究[J].肉類研究，2010（6）：78-81.

[2]宋迪，吉愛(ài)國(guó)，梁浩，等.刺參生物活性物質(zhì)的研究進(jìn)展[J].中國(guó)生化藥物雜志，2006，27（5）：316-319.

[3]謝永玲，張明月，張靜，等.海參肽對(duì)小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用[J].中國(guó)海洋藥物雜志，2009，28（4）：43-45.

[4]高森，王靜鳳，王玉明，等.冰島刺參調(diào)節(jié)血脂及其作用機(jī)制[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào)：理學(xué)版，2009，55（3）：324-328.

[5]逄龍，王靜鳳，王玉明，等.北極刺參多糖、皂苷和膠原蛋白多肽對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，38（5）：437-441.

[6]段續(xù)，王輝，任廣躍，等.海參的干制技術(shù)及其研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2012，33（10）：427-431.

[7]趙露露，董秀萍，于蕾，等.海參體壁組織蛋白酶B酶學(xué)性質(zhì)的研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2008，29（8）：5-9.

[8]徐夏旸，張甫生，陳芳，等.超高壓殺菌白蘿卜汁的關(guān)鍵工藝研究[J].食品科學(xué)，2012，33（4）：8-12.

[9]LOPEZ-CABALLERO M E，PEREZ M M，BORDERIAS J，et al.Extension of shelf-life of prawns（Penaeus japonicus）by vacuum packaging and high-pressure treatment[J].Journal of Food Protection，2000，63（10）：1381-1388.

[10]KURAL A G，CHEN H.Conditions for a 5-log reduction of Vibrio vulnificus in oysters through high hydrostatic pressure treatment[J].International Journal of Food Microbiology，2008，122：180-187.

[11]曾慶梅，潘見(jiàn)，謝慧明，等.超高壓處理對(duì)多酚氧化酶活性的影響[J].高壓物理學(xué)報(bào)，2004，18（2）：144-148.

[12]陳賀慶，潘思軼，王可興.超高壓處理對(duì)鮮橙汁中果膠酶及過(guò)氧化物酶活性的影響[J].食品科學(xué)，2011，32（15）：54-57.

[13]CAMPUS M，ADDIS M F，CAPPUCCINELLI R，et al.Stress relaxation behaviour and structural changes of muscle tissues fromGilthead Sea Bream（Sparus aurata L.）following high pressure treatment[J].Journal of Food Engineering，2010，96：192-198.

[14]林淑英，孔保華.超高壓對(duì)食品中的酶的影響[J].食品與機(jī)械，1999（5）：30-31.

[15]HENDRICKX M，LUDIKHUYZE L，VANDENBROCAK I，et al.Effect of High Pressure on Enzymes Related to Food Quality[J].Food Science and Technology，1998（9）：197-203.

[16]LUDIKHUYZE L， INDRAWATI， BROECK I V D， et al.Effect of Combined pressure and temperature on soybean lipoxygense.Influence of extrinsic and intrinsic factors on isobaricisothermal inactivation kinetics[J].J Agric Food Chem，1998，46（10）：4074-4080.

[17]BROECK I V D，LUDIKHUYZE L R，LOEY A M V，et al.Inactivation of orange pectinesterase by combined high-pressure and temperature treatments：a kinetic study[J].J Agric Food Chem，2000，48（5）：1960-1970.

[18]勵(lì)建榮，俞堅(jiān).超高壓對(duì)酶活的影響[J].食品科技，2006（9）：18-20.

[19]朱蓓薇，韓冰.海參自溶酶的分離純化和部分性質(zhì)研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2004，30（4）：132-137.

[20]夏遠(yuǎn)景，劉志軍，李寧，等.超高壓處理對(duì)海參自溶酶活性影響的研究[J].高壓物理學(xué)報(bào)，2009，23（5）：377-383.

[21]杜英，朱蓓薇，吳海濤，等.海參乙酰膽堿酯酶的酶學(xué)特性研究[J].食品與機(jī)械，2011，27（2）：8-12.

[22]TURK B，TURK D，TURK V.Lysosomal cysteine proteases：more than scavengers[J].Biochimica et Biophysica Acta，2000，1477：98-111.

[23]趙露露，董秀萍，于蕾，等.海參體壁組織蛋白酶B酶學(xué)性質(zhì)的研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2008，29（8）：5-9.