郭容利, 何孔旺, 倪艷秀, 茅愛華, 溫立斌, 李 彬, 王小敏, 俞正玉
(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所,農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點實驗室,國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心,江蘇 南京 210014)
豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis of pigs virus,TGEV)和豬A群輪狀病毒(Porcine group A rotavirus,PARV)是引起仔豬腹瀉的主要腸道病毒[1]。三者有類似的傳染途徑和臨床癥狀,感染豬均表現(xiàn)為水樣腹瀉、嘔吐、脫水及新生仔豬的高死亡率,三者流行病學(xué)和病理剖檢也極其相似,但三種病原沒有共同的抗原性,不能交互免疫,而又有混合感染,也易繼發(fā)其他細(xì)菌性感染,導(dǎo)致仔豬死亡率升高或生長緩慢,尤其是近幾年,在中國病毒性腹瀉暴發(fā)嚴(yán)重,仔豬的死亡率上升[2-4],給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。PEDV、TGEV和PARV傳統(tǒng)的診斷方法主要有:病毒分離、組織培養(yǎng)及用免疫學(xué)方法診斷抗原[5-7]。常規(guī)的RT-PCR也廣泛應(yīng)用于這三種病毒的檢測[8-10],而且RT-PCR因能快速檢測出微量核酸而更具優(yōu)越性。本試驗旨在建立一種多重RT-PCR法,可快速直接地檢測臨床樣品,同時區(qū)分鑒別診斷PEDV、TGEV和PARV三種腹瀉病毒,為進(jìn)行豬病毒性腹瀉的流行病學(xué)調(diào)查和防控奠定一定的基礎(chǔ)。
豬流行性腹瀉病毒(PEDV)CV777毒株、豬傳染性胃腸炎(TGEV)JSXB2010毒株、豬A群輪狀病毒(PARV)Nan86毒株、豬瘟病毒(HCV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬偽狂犬病毒(PRV)均由本實驗室保存。
病料來自2011年10月~2013年2月江蘇省及周邊地區(qū)豬場的疑患病毒性腹瀉仔豬的糞便或小腸組織共154份。
Trizol LS Reagent為美國Invitrogen公司產(chǎn)品;反轉(zhuǎn)錄試劑盒為美國Promega公司產(chǎn)品;AxyPrep TM plasmid miniprep kit、Agarose gel DNA purification kit購自Axygen公司;pMD18-T載體克隆試劑盒、各限制性內(nèi)切酶、DNA marker DL 2000等均購自TaKaRa公司;2×HSTMmix購自東盛公司;大腸桿菌DH5α由本實驗室保存;氯仿、異丙醇、無水乙醇購自上?;瘜W(xué)試劑有限公司。
根據(jù)GenBank上公布的PEDV核蛋白N基因序列、TGEV糖膜蛋白M基因序列、PARV內(nèi)衣殼蛋白VP6基因序列,分別在其保守區(qū)設(shè)計1對特異性引物(表1),由上海英駿技術(shù)有限公司合成。
表1 引物序列Table 1 Sequences of the primers
在被檢樣品 200 μl上清中加入 TRIzol 800 μl,振蕩混勻后,室溫放置5 min;加入氯仿200 μl,劇烈振蕩后,室溫放置10 min;4℃ 12 000 r/min離心10 min,取上清,加入等量異丙醇,混勻,-20℃放置2 h以上;4℃ 12 000 r/min離心15 min,去上清,沉淀用1 ml 75%的無RNA酶的乙醇洗滌;4℃ 7 500 r/min離心5 min去上清,室溫干燥RNA沉淀20 min,加入DEPC水20 μl,充分溶解,-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>
參照Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書。反應(yīng)體系:樣品RNA 模板2.0 μl,10×RT buffe反轉(zhuǎn)錄緩沖液 2.0 μl,dNTP(10 mmol/L)2.0 μl ,MgCl2(25 mmol/L)3.0 μl,RNasin 0.5 μl,AMV 反轉(zhuǎn)錄酶 0.5 μl,隨機(jī)引物 1.0 μl,加 ddH2O 至終體積 20.0 μl。反轉(zhuǎn)錄程序:25℃反應(yīng)15 min,42℃孵育60 min,95℃ 5 min,同時設(shè)立陰性、陽性對照。cDNA產(chǎn)物于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
單項PCR擴(kuò)增cDNA PCR反應(yīng)總體系為25.00 μl:2 ×HSTMMix 12.50 μl,上游引物和下游引物(20 pmol/μl)各 0.25 μl,cDNA 2.00 μl,加 ddH2O 至終體積25.00 μl。反應(yīng)參數(shù):95℃預(yù)變性4 min;94℃變性30 s,53℃退火30 s,72℃ 延伸30 s,共35個循環(huán);最后72℃延伸7 min。反應(yīng)結(jié)束后,用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察。
將退火溫度設(shè)定為50.8℃、52.4℃、54.1℃、55.8℃、57.5℃、59.2℃ 6個梯度,上下游引物均取0.25 μl,采用不同的退火溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增,根據(jù)試驗結(jié)果,大致確定單項PCR最佳退火溫度的范圍。
根據(jù)方法1.6,在確定的退火溫度范圍內(nèi),改變3對引物(上游引物和下游引物濃度均為 20 pmol/μl)的體積(表2),在其他條件不變的情況下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
表2 RT-PCR引物體積分組Table 2 The grouping of the RT-PCR primer volume
分別取 PEDV、TGEV和 PARV混合 cDNA模板,PEDV,TGEV,PARV,HCV,PRRSV,VERO、ST、Marck145三種細(xì)胞混合物 cDNA模板,PCV2,PRV DNA模板,以H2O作為陰性對照,在方法1.7確定的退火溫度和引物濃度下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
將3種病毒等量(各病毒含量107TCID50/ml)混合后提取的RNA全部反轉(zhuǎn)錄所得cDNA按10倍倍比(100~108)稀釋,各稀釋度樣品在確定的退火溫度和3對引物濃度的情況下,其他條件不變進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
利用所建立的多重RT-PCR方法檢測來自2011年10月~2013年2月江蘇省及周邊地區(qū)豬場的疑患病毒性腹瀉仔豬的糞便或小腸組織共154份病料。
將4份PEDV、1份TGEV和1份PARV多重RT-PCR臨床檢驗的陽性產(chǎn)物回收、克隆、酶切鑒定后送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序,利用NCBI中的BLAST軟件對測序結(jié)果進(jìn)行序列比對。
采用不同的退火溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖1),退火溫度在52.4至55.8℃之間試驗效果相對較好。
在52.4℃、54.1℃、55.8℃ 3種退火溫度下,改變3對引物的濃度,在其他條件不變的情況下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果(圖2),確定PEDV、TGEV和PARV多重RT-PCR最佳的條件為:退火溫度54.1℃,引物體積組合為第3組(PEDVN1/N2:0.5 μl/0.5 μl;TGEVM1/M2:0.5 μl/0.5 μl;PARVVP61/VP62:0.25 μl/0.25 μl)。
用建立的多重 RT-PCR對 PEDV、TGEV和PARV 混合 cDNA 模板,PEDV,TGEV,PARV,HCV,PRRSV,Vero、ST、Marck145 混合細(xì)胞 cDNA 模板,PCV2、PRV DNA模板,ddH2O空白對照進(jìn)行擴(kuò)增(圖3),只有PEDV、TGEV和 PARV混合 cDNA模板及PEDV、TGEV和PARV cDNA模板擴(kuò)增出與目的片段大小一致的條帶。說明本試驗建立的多重RT-PCR具有很好的特異性。
將三種病毒混合后提取的RNA全部反轉(zhuǎn)錄所得cDNA按10倍倍比稀釋,在確定的退火溫度以及引物濃度下,其他條件不變,進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖4)。假定所提取的RNA無降解,全部反轉(zhuǎn)錄,此多重RT-PCR可檢測到約50 TCID50的混合病毒量。
圖1 PEDV、TGEV和PARV單項RT-PCR退火溫度范圍Fig.1 Annealing temperature of RT-PCR for PEDV,TGEV and PARV detection,respectively
圖2 多重RT-PCR引物濃度與退火溫度Fig.2 Primer concentration and annealing temperature of multiplex RT-PCR
圖3 多重RT-PCR的特異性Fig.3 Specificity of the multiplex RT-PCR assay
利用多重RT-PCR檢測了仔豬腹瀉的糞便或小腸組織共154份病料。PEDV、TGEV和PARV的陽性率分別為 53.2%,8.4% 和 5.2%。PEDV、TGEV共感染的概率為5.2%,PEDV與PARV共感染的概率為 4.5%。
圖4 多重RT-PCR的敏感性Fig.4 Sensitivity of the mutiplex RT-PCR assay
將4株P(guān)EDV、1株TGEV、1株P(guān)ARV陽性病料PCR產(chǎn)物回收克隆測序,利用NCBI中BLAST軟件對所測序列進(jìn)行比對。結(jié)果顯示:4株P(guān)EDV的N基因序列與參考的CV777毒株(AF353511)同源性為分別為95.3%、97.6%、96%、95.7%;1株TGEV的M基因序列與參考的WH-1毒株(HQ462571.1)同源性為99%;1株P(guān)ARV與Porcine rotavirus A strain CMP34/00(EU372782)VP6序列的同源性為95%。測序結(jié)果進(jìn)一步證明了建立的多重RT-PCR檢測方法具有良好的特異性。
常規(guī)的病毒診斷方法有病毒分離、熒光抗體檢測和免疫組織化學(xué)法等,但都有一些缺陷。目前,病毒分離相當(dāng)困難,熒光抗體檢測和免疫組織化學(xué)法有非特異性,PCR方法因其具有快速、特異、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點現(xiàn)己經(jīng)廣泛應(yīng)用于畜禽傳染病的快速診斷,但是,目前單一的RT-PCR方法用于多種病毒感染的臨床鑒別診斷,不能一次達(dá)到目的。而多重RT-PCR方法與上述檢測方法相比,存在顯著優(yōu)勢:能一次確診單一感染或混合感染,達(dá)到診斷和鑒別的雙重目的;比傳統(tǒng)檢測方法更方便快速。
本試驗通過設(shè)計分別針對 PEDV、TGEV和PARV的3對特異性引物,將 PEDV、TGEV、PARV做陽性對照,對多重RT-PCR反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,并對其特異性與敏感性進(jìn)行了試驗。試驗結(jié)果證明該方法的特異性強(qiáng)、敏感性高,PCR產(chǎn)物測序結(jié)果進(jìn)一步證明了建立的多重RT-PCR檢測方法具有良好的特異性,可應(yīng)用于臨床鑒別診斷。本試驗建立的多重RT-PCR檢測方法采用商品化的反轉(zhuǎn)錄試劑盒,保障了試劑的標(biāo)準(zhǔn)化,運用其中的隨機(jī)引物可一次性反轉(zhuǎn)錄多種RNA病毒,減少操作步驟,更有利于標(biāo)準(zhǔn)化臨床檢測,具有較高的實用價值。此方法的建立為這3種病毒性腹瀉的流行病學(xué)調(diào)查奠定了基礎(chǔ)。
在中國,近幾年來,豬群中由病毒感染引起的仔豬腹瀉非常嚴(yán)重,而PEDV感染尤其嚴(yán)重,其感染率明顯高于另外的2個豬病毒性腹瀉病原,即豬傳染性胃腸炎(TGEV)和豬A群輪狀病毒(PARV)[9,11-13]。在本研究中,應(yīng)用建立的多重 RTPCR方法對來自2011年10月~2013年2月江蘇省及周邊地區(qū)豬場的疑患病毒性腹瀉仔豬的糞便或小腸組織共154份病料進(jìn)行了檢測,結(jié)果表明,豬群中豬流行性腹瀉病毒感染率仍然較高,達(dá)到了53.2%,而TGEV、PARV的陽性率相對較低,分別是8.4%、5.2%,從檢測的結(jié)果來分析,豬群中也存在幾種病毒共感染的現(xiàn)象。當(dāng)這三種病毒有混合感染時,發(fā)病豬的癥狀較嚴(yán)重,致使仔豬死亡率上升。因此,為了預(yù)防病毒性腹瀉的發(fā)生,加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和有效的疫苗接種是很有必要的。
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