向 導(dǎo) 袁 林 蘇林沖 向 陽 (湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院，恩施 445000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種病變累及周圍關(guān)節(jié)的多系統(tǒng)性炎癥性的自身免疫病，主要表現(xiàn)為慢性、對稱性、多滑膜關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)外病變［1］。常因沒有早期診斷和治療，而在發(fā)病兩年內(nèi)即可出現(xiàn)不可逆的骨關(guān)節(jié)破壞，造成關(guān)節(jié)畸形以及功能喪失，最終殘疾［2］?；そM織的改變在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中最為顯著，病變滑膜(液)中有大量浸潤的巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，這些炎性細(xì)胞和滑膜中固有細(xì)胞相互作用，造成骨和軟骨的破壞，因此，抑制自身免疫反應(yīng)的細(xì)胞增殖及促進(jìn)該免疫反應(yīng)的細(xì)胞凋亡，阻止關(guān)節(jié)滑膜中炎性細(xì)胞的浸潤可減輕關(guān)節(jié)炎病變，是治療關(guān)節(jié)炎的一條重要途徑［3］。

本實(shí)驗采用本院自制藥劑復(fù)方金邊祛風(fēng)飲(每100 ml生藥含量為金邊七15 g、見血飛20 g、人血草12 g、香雪藤 15 g、破血丹 15 g、穿山龍 15 g、雪里見15 g、赤芍20 g、竹節(jié)參15 g)為治療藥物，實(shí)驗觀察藥物對培養(yǎng)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者膝關(guān)節(jié)液滑膜細(xì)胞的改變及炎性細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α和MMP-3的影響，探討金邊祛風(fēng)飲在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的運(yùn)用。

1 材料與方法

1．1 材料 RA和OA患者膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)液取自本院風(fēng)濕免疫科患者，其中類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)6例，骨關(guān)節(jié)炎(OA)6例。標(biāo)本采集前2周，患者均未使用過激素類或免疫抑制劑類藥物，其中RA依照1987年美國風(fēng)濕病學(xué)會(ACR)標(biāo)準(zhǔn);OA患者診斷按ACR1986年標(biāo)準(zhǔn)。本研究均獲得研究對象知情同意。

細(xì)胞完全培養(yǎng)液的配制:含DMEM(高糖)培養(yǎng)基84% ～89%、胎牛血清10% ～15%、HEPES 1%。加入雙抗(青霉素+鏈霉素)貯存液，使青霉素和鏈霉素的終濃度均為100 U/ml，調(diào)節(jié)pH 值7．0～7．2，于4℃保存。

1．2 方法 患者在無菌條件下行膝關(guān)節(jié)穿刺術(shù)，取其關(guān)節(jié)液后置含肝素鈉的離心管中，在4℃，1 000 r/min離心10分鐘;棄上清，用DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將收集到的細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于培養(yǎng)箱，5%CO2、37℃培養(yǎng);細(xì)胞貼壁后，每2～3天更換1次培養(yǎng)液，并用D-hank’s漂洗培養(yǎng)瓶，去除懸浮的非貼壁細(xì)胞，重復(fù)2～3次;待細(xì)胞長滿后，用0．25%EDTA胰蛋白酶消化細(xì)胞，按1∶3比例傳代，復(fù)種于6孔無菌細(xì)胞培養(yǎng)板中，本例選用第2代生長穩(wěn)定的滑膜細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗。

1．2．1 分組 根據(jù)前期研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)金邊祛風(fēng)飲藥物濃度為0．65 mg/ml時，滑膜細(xì)胞死亡較多，當(dāng)藥物濃度為65μg/ml時，細(xì)胞形態(tài)無明顯變化;當(dāng)藥物濃度為6．5μg/ml時，生長狀態(tài)良好，故將藥物濃度選在6．5～65 μg/ml。分別設(shè)藥物濃度10 μg/ml為低劑量組、30μg/ml為中劑量組、60μg/ml為高劑量組。

1．2．2 細(xì)胞培養(yǎng)液上清液中炎性因子 取生長良好的RA和 OA滑膜細(xì)胞，按細(xì)胞濃度為1×103ml－1，每孔100 μl接種于96孔培養(yǎng)板，置入二氧化碳培養(yǎng)箱，待3～4小時細(xì)胞貼壁后再補(bǔ)液至200 μl。培養(yǎng)24小時后，吸去懸浮細(xì)胞，在每孔中分別加入金邊祛風(fēng)飲，濃度分別為 10、30、60 μg/ml，刺激細(xì)胞72小時，收集上清。用ELISA法分別檢測其中的 TNF-α、IL-1β 和 MMP-3水平。

1．2．3 滑膜細(xì)胞增殖率 取生長良好的RA和OA滑膜細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，接種于無菌96孔板(每板第一個孔不接種細(xì)胞，只加培養(yǎng)液，為空白凋零孔)，加入細(xì)胞懸液與培養(yǎng)液各100μl;置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底，24小時后加入金邊祛風(fēng)飲，藥物濃度分別為10、30和60 μg/ml，陰性對照組，常規(guī)換液;每組設(shè)5個復(fù)孔，每孔100μl;于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中孵育16～48小時后，在倒置顯微鏡下觀察;每孔分別加入5 mg/ml(0．5%)的 MTT溶液20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4小時。離心，棄培養(yǎng)液，用D-hank’s液沖2～3遍，再次加入培養(yǎng)液后終止培養(yǎng)，小心將每孔內(nèi)的培養(yǎng)液吸去;每孔分別加入二甲基亞砜(DMSO)150μl，置搖床上低速振蕩5～10分鐘，讓結(jié)晶物充分溶解。酶聯(lián)免疫檢測儀測定每孔吸光度(490 nm波長處)。

2 結(jié)果

2．1 滑膜細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變 給藥刺激前培養(yǎng)的RA、OA組細(xì)胞貼壁生長，幾乎無脫落，胞漿飽滿，生長舒展，相鄰細(xì)胞生長融合成片(見圖1A、C);經(jīng)金邊祛風(fēng)飲刺激72小時后，光鏡下可見RA滑膜細(xì)胞密度有一定程度降低;細(xì)胞形態(tài)亦發(fā)生相應(yīng)改變，細(xì)胞體積明顯縮小，部分由貼壁脫落呈懸浮生長，貼壁能力減弱，細(xì)胞核出現(xiàn)固縮，細(xì)胞膜完整(見圖1B);而在OA治療組，細(xì)胞體積與給藥前變化不明顯，細(xì)胞密度較前有所降低，仍以長梭形細(xì)胞多見，大部分細(xì)胞仍呈貼壁狀，細(xì)胞透明性加強(qiáng)(見圖1D)。

2．2 上清中 TNF-α、IL-1β 和 MMP-3水平 ELISA法檢測培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子和基質(zhì)金屬蛋白酶的結(jié)果見表1。不同濃度金邊祛風(fēng)飲刺激滑膜細(xì)胞72小時后，培養(yǎng)上清液中的 TNF-ɑ、IL-1β、MMP-3 均降低，與OA對照組比較有顯著差異(P＜0.05)，與空白對照組相比具有極顯著性差異(P＜0.01)。組間比較，高劑量組在降低TNF-α、IL-1β和MMP-3水平中有顯著性差異(P＜0.05)

2．3 RA及OA滑膜細(xì)胞增殖率 濃度分別為10、30、60μg/ml的金邊祛風(fēng)飲刺激 RA、OA滑膜細(xì)胞72小時(同時設(shè)空白對照)，細(xì)胞的增殖率見表2，結(jié)果顯示，與OA對照組相比，RA滑膜細(xì)胞在3個濃度梯度，均能引起增殖率顯著增高，而OA滑膜細(xì)胞在各藥物濃度刺激下，細(xì)胞增殖率沒有顯著改變。

表1 細(xì)胞培養(yǎng)液上清液中IL-1β、TNF-ɑ、MMP-3的測定 ±s，n=6)Tab．1 Determ ination of cell culture supernatant of IL-1β，TNF-αand MMP-3 ±s，n=6)

表1 細(xì)胞培養(yǎng)液上清液中IL-1β、TNF-ɑ、MMP-3的測定 ±s，n=6)Tab．1 Determ ination of cell culture supernatant of IL-1β，TNF-αand MMP-3 ±s，n=6)

Note:Compared RA high dose group with RA controlgroup，1)P＜0.01;Compared RA treatmentgroup with OA treatmentgroup ，2)P＜0．05;Compared RA high dose group with RA low dosegroup，3)P＜0．05．

Groups TNF-ɑ(ng/ml)IL-1β(ng/ml)MMP-3(ng/m l)RA control 115．90±5．19 127．42±4．83 431．20±3．69 RA high dose 31．98±3．271)2)3) 27．39±1．741)2)3) 294．30±7．121)2)3)RA middle dose 67．39±1．892) 69．77±1．892) 327．62±5．322)RA low dose 72．67±2．792) 75．06±0．972) 349．27±3．832)OA high dose 85．41±2．49 85．95±1．39 386．64±4．37 OA middle dose 85．45±2．31 86．31±2．21 384．91±6．99 OA low dose 86．69±2．45 87．43±1．46 386．34±6．15

圖1 倒置顯微鏡下RA及OA滑膜細(xì)胞形態(tài)變化(×40)Fig．1 Inverted in m icroscope RA and OA synovial cell morphological changes(×40)

表2 MTT法檢測滑膜細(xì)胞增殖 ±s，n=6)Tab．2 MTT assay proliferation of synovial cells ±s，n=6)

表2 MTT法檢測滑膜細(xì)胞增殖 ±s，n=6)Tab．2 MTT assay proliferation of synovial cells ±s，n=6)

Groups n Inhibition ratio(%)RA control 6 2．25±3．14 RA high dose 6 39．26±2．461)2)3)RA middle dose 6 28．41±3．252)RA low dose 6 22．41±1．682)OA high dose 6 8．57±3．24 OA middle dose 6 7．71±2．38 OA low dose 6 7．37±2．12

3 討論

由類風(fēng)濕性滑膜中的巨噬細(xì)胞、纖維母細(xì)胞或滑液中的中性白細(xì)胞生成的炎性因子TNF-α和IL-1β在RA的病情進(jìn)程中處于中心地位。TNF-α和IL-1β在活動性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中主要參與病理的過程是:刺激多形核細(xì)胞和結(jié)締組織細(xì)胞，產(chǎn)生前列腺素等小分子炎癥介質(zhì);激活血管內(nèi)皮細(xì)胞，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子的表達(dá)，在關(guān)節(jié)炎時，正是通過與粘附分子的互相作用，使血液中的白細(xì)胞被匯集到關(guān)節(jié)腔內(nèi);通過刺激骨膜細(xì)胞和破骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞，使糖蛋白的合成減少、降解增加，同時產(chǎn)生釋放骨鈣的膠原酶和其他中性蛋白酶，從而導(dǎo)致骨和軟骨破壞［4］。大量研究證實(shí)RA患者關(guān)節(jié)滑液和外周血TNF-α和IL-1增高與RA患者關(guān)節(jié)滑膜液的巨噬細(xì)胞及外周血單核細(xì)胞分泌TNF-α及IL-1有關(guān)。經(jīng)發(fā)現(xiàn)由T細(xì)胞分泌的淋巴毒素(Lymphotoxin，LT)與腫瘤壞死因子同時作用于相同受體，并且兩者在氨基酸序列上的同源性較高，遂將淋巴毒瘤命名為TNF-β，將原來的腫瘤壞死因子命名為 TNF-α。TNF-α是一種具有主要的免疫調(diào)節(jié)和前炎性等多方面功能的細(xì)胞因子，且能夠引起腫瘤組織的出血壞死。TNF-α在關(guān)節(jié)病變中，刺激軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞合成膠原酶與前列腺素E2(Prostaglandin E2)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增生，致使骨和軟骨的吸收破壞。Yocum［6］認(rèn)為在疾病活動期或進(jìn)展期，TNF-α 進(jìn)入外周血流，同時自身高水平分泌，從而導(dǎo)致局部關(guān)節(jié)組織的破壞，以及一系列臨床癥狀，而在疾病的慢性期，TNF-α分泌水平相對偏低且較穩(wěn)定。TNF-α在正常人血清中約(4～5 ng/ml或0～2 U/ml)，滑液中為35 pg/ml，而在RA病人外周血中其水平明顯升高。(RA病人血清中為4．3～330 pg/ml;滑液中為120 ～137 pg/ml)［7］。IL-1β 這一炎性細(xì)胞因子在RA滑膜增生與關(guān)節(jié)破壞中發(fā)揮著重要作用，現(xiàn)認(rèn)為局部的巨噬細(xì)胞被關(guān)節(jié)內(nèi)免疫復(fù)合物活化，分泌大量的IL-1，進(jìn)而使細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)活化，活化的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)誘導(dǎo)關(guān)節(jié)腔內(nèi)的單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤，介導(dǎo)關(guān)節(jié)滑膜炎癥的發(fā)生與發(fā)展［8］。研究還發(fā)現(xiàn)，IL-1mRNA也高表達(dá)于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的外周血細(xì)胞中，所以血清IL-1β濃度與關(guān)節(jié)液內(nèi)IL-1β含量有相當(dāng)密切的關(guān)系［9］。可以看出，IL-1β不僅作用于RA細(xì)胞免疫的激活，而且還與機(jī)體整體的體液免疫有關(guān)。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一組含Zn2+的蛋白水解酶，其作用之一是使細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)的所有蛋白成分降解，導(dǎo)致韌帶、軟骨及骨的破壞。MMPs的活化被認(rèn)為是ECM降解的限速環(huán)節(jié)［10］，在此過程中還可使其他的 MMPs激活，此效應(yīng)在組織塑型、胚胎發(fā)育中起著極其重要的作用。機(jī)體組織內(nèi)的金屬蛋白酶組織抑制劑(Tissue inhibitor ofmetalloproteinases，TIMPs)可抑制MMPs的活性，在正常機(jī)體中，MMPs與TIMPs之間保持著一種動態(tài)平衡的格局，一旦這種平衡的格局被打破，多種病理過程就隨之產(chǎn)生［11］。MMPs廣泛存在于各種結(jié)締組織中，現(xiàn)代研究認(rèn)為MMP-1、MMP-3與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)系最為密切，是導(dǎo)致關(guān)節(jié)被破壞的重要因素，在晚期類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)滑膜中，MMP-1、MMP-3 水平表達(dá)更高［12］。MMP-3的mRNA水平在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)軟骨與血管翳連接部位明顯升高，證明其在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的骨與軟骨的破壞中起重要作用，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清中MMP-3水平增高被認(rèn)為源自關(guān)節(jié)，其原因為:①滑液中MMP-3水平比在血清中高250倍;②隨受損關(guān)節(jié)數(shù)量增多，血清MMP-3水平亦相應(yīng)增高;③在關(guān)節(jié)腔內(nèi)局部注入皮質(zhì)類固醇之后，血清MMP-3水平明顯下降［13］。MMP-3這一系統(tǒng)性的炎癥標(biāo)志物，現(xiàn)已被認(rèn)為是誘導(dǎo)軟骨降解最重要的蛋白酶，并可作為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者滑膜損傷以及預(yù)后的指標(biāo)。

金邊祛風(fēng)飲能有效抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞增殖，以及調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α的分泌及MMP-3表達(dá)，可能為其重要作用機(jī)制，從而使關(guān)節(jié)炎癥減輕。本研究為金邊祛風(fēng)飲治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的臨床應(yīng)用提供了試驗依據(jù)，為今后更加深入地研究金邊祛風(fēng)飲奠定了基礎(chǔ)。

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