劉偉杰，王瑩瑩，李佳桓，杜鋼軍

（河南大學(xué)藥學(xué)院 藥物研究所，河南 開(kāi)封 475004）

腫瘤是一種基因病，已經(jīng)成為威脅人類健康的第一大疾病，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。手術(shù)、放療、化療是臨床上治療腫瘤的三大有效手段。化療對(duì)患者體內(nèi)的癌細(xì)胞有很強(qiáng)的殺傷作用，可以提高療效，改善預(yù)后，但是，也有很強(qiáng)的不良反應(yīng)。其中最常見(jiàn)的是骨髓抑制，往往使化療的療程和劑量受到限制，導(dǎo)致化療的失敗。

中藥在緩解藥物的不良反應(yīng)和增加藥物的療效方面都有明顯的作用，并且在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥方面有明顯的作用。槲皮素（quercetin，簡(jiǎn)稱QU，為3，4，5＇，3＇，4＇－五羥基黃酮）及其衍生物是植物界分布最廣的黃酮類化合物，具有多種生物活性和很高的藥用價(jià)值，也是人類飲食中最主要的生物類黃酮。近幾年，槲皮素的性能引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，并對(duì)其生物活性、藥理作用都進(jìn)行了大量的研究。槲皮素具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、降低毛細(xì)血管通透性和脆性、抗病毒、抗炎、抗腫瘤、抗纖維化、抗血小板聚集、抗過(guò)敏、鎮(zhèn)痛、抗氧化、清除自由基等多種藥理作用［1］。我們用小鼠Lewis肺癌以及乳腺癌實(shí)驗(yàn)，研究了槲皮素對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用以及對(duì)機(jī)體免疫功能的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要試劑

無(wú)水乙醇（分析純，天津市德思化學(xué)試劑有限公司，20061027）；Tween80（分析純，天津市紅巖化學(xué)試劑廠，20060824）；二甲基亞砜（DMSO，分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠，20060702）；丙酮（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心，2004111）1；槲皮素（純度98%，陜西薈科天然產(chǎn)物有限公司提供，臨用前制成注射用溶液）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及瘤株

C57BL／6、BALB／c小鼠，雌性，6～8 周，18～22g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供；C57BL／6小鼠Lewis肺癌瘤株、BALB／c小鼠4T1乳腺癌瘤株均購(gòu)于上海細(xì)胞所；本實(shí)驗(yàn)室C57BL／6、BABL／c小鼠自身傳代保存的實(shí)體瘤。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

潔凈工作臺(tái)（100級(jí)潔凈等級(jí)，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；快速混勻器（SK－1，常州國(guó)華電器有限公司）；不銹鋼手提式滅菌器（DSX－280A，上海市申安醫(yī)療器械廠）；臺(tái)式離心機(jī)（TDL－50B，上海安亭科學(xué)儀器廠）；電子天平（FA1004N，上海精密科學(xué)儀器有限公司）；移液器20～200 μL、100～1000μL（法國(guó)吉爾森公司）。

2 方法

2.1 對(duì)小鼠Lewis肺癌術(shù)后肺轉(zhuǎn)移的影響

將在體小鼠Lewis肺癌實(shí)體瘤組織用組織勻漿器制備單細(xì)胞懸液，調(diào)細(xì)胞數(shù)1×106個(gè)／mL。0.2mL／只接種于20只C57BL／6小鼠右足趾皮下，接種次日開(kāi)始腹腔注射給藥。對(duì)照組給予空白溶劑（10 mL／kg）；槲皮素實(shí)驗(yàn)治療組用槲皮素（10mg／kg）注射，每組10只小鼠。待腫瘤長(zhǎng)至直徑約5mm 時(shí)截去荷瘤全足，繼續(xù)治療3周，處死小鼠，切除肺臟，稱重，觀察腫瘤肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)和免疫器官臟器指數(shù)。肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)方法：將稱重后的肺臟按其原始5 葉切開(kāi)，以體積分?jǐn)?shù)10%的甲醛溶液固定24h，再用生理鹽水沖洗，計(jì)數(shù)各組肉眼可見(jiàn)肺癌轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)總數(shù)。

2.2 對(duì)小鼠4T1乳腺癌術(shù)后肺轉(zhuǎn)移的影響［2－3］

將在體小鼠4T1乳腺癌實(shí)體瘤組織用組織勻漿器制備單細(xì)胞懸液，調(diào)細(xì)胞數(shù)1×106個(gè)／mL。0.2mL／只接種于20 只BALB／c小鼠右足趾皮下，接種次日開(kāi)始腹腔注射給藥。對(duì)照組給予空白溶劑（10mL／kg）；槲皮素實(shí)驗(yàn)治療組用槲皮素（10mg／kg）注射，每組10只小鼠。待腫瘤長(zhǎng)至直徑約5mm 時(shí)截去荷瘤全足，繼續(xù)治療3周，處死小鼠，切除肺臟，稱重，觀察腫瘤肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)和免疫器官臟器指數(shù)。肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)方法：將稱重后的肺臟按其原始5 葉切開(kāi)，以體積分?jǐn)?shù)10%的甲醛溶液固定24h，再用生理鹽水沖洗，計(jì)數(shù)各組肉眼可見(jiàn)肺癌轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)總數(shù)。

2.3 對(duì)荷瘤小鼠免疫功能的影響［4－5］

按前述方法制備4T1 乳腺癌腫瘤細(xì)胞，將腫瘤細(xì)胞接種于小鼠后肢皮下，次日開(kāi)始給藥，劑量同前，連續(xù)3周。腫瘤長(zhǎng)出后，用排水容積法每周測(cè)量腫瘤體積2次。治療結(jié)束次日，將小鼠處死，切除腫瘤、脾臟、淋巴結(jié)，稱重。脾臟指數(shù)＝脾臟質(zhì)量（mg）／體質(zhì)量（g）。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 對(duì)小鼠Lewis肺癌及4T1乳腺癌術(shù)后肺轉(zhuǎn)移的影響

槲皮素對(duì)小鼠lewis肺癌及4T1乳腺癌術(shù)后肺轉(zhuǎn)移有抑制作用，能明顯減少腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)，對(duì)轉(zhuǎn)移后的腫瘤生長(zhǎng)也有明顯的抑制作用（見(jiàn)表1、圖1、圖2）。

表1 槲皮素對(duì)小鼠Lewis肺癌及4T1乳腺癌術(shù)后肺轉(zhuǎn)移的影響（，n＝10）

3.2 槲皮素對(duì)荷瘤小鼠免疫功能的影響

槲皮素對(duì)4T1乳腺癌荷瘤小鼠脾臟指數(shù)有明顯降低作用，可以使淋巴結(jié)縮小，使皮下腫瘤生長(zhǎng)減緩，分別見(jiàn)表2、圖3、圖4。

表2 槲皮素對(duì)4T1乳腺癌荷瘤小鼠脾臟指數(shù)和腫瘤大小的影響（，n＝10）

圖1 槲皮素對(duì)Lewis肺癌術(shù)后肺轉(zhuǎn)移的影響

圖2 槲皮素對(duì)4T1乳腺癌術(shù)后肺轉(zhuǎn)移的影響

圖3 槲皮素對(duì)4T1乳腺癌荷瘤小鼠淋巴結(jié)大小的影響

圖4 槲皮素對(duì)4T1皮下腫瘤生長(zhǎng)的影響

4 討論

化療藥物毒性大、對(duì)腫瘤細(xì)胞選擇性差，尤其是對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的破壞，容易導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)。如果藥物既能直接殺傷腫瘤細(xì)胞，又能增強(qiáng)機(jī)體自身免疫，對(duì)治療腫瘤無(wú)疑非常有利。一些小分子天然產(chǎn)物，因獨(dú)特的作用機(jī)制及對(duì)機(jī)體無(wú)毒情況下的抗腫瘤作用，備受人們關(guān)注。

近年來(lái)研究［6－10］表明，槲皮素在抗腫瘤轉(zhuǎn)移方面顯示出明顯功效。其作用機(jī)制可能為：①對(duì)細(xì)胞周期的作用。槲皮素在肺癌細(xì)胞中可下調(diào)變異的p53 蛋白，使它的表達(dá)達(dá)到一個(gè)幾乎不可檢測(cè)的水平，且濃度越低，下調(diào)作用越弱。p53表達(dá)的抑制使得細(xì)胞停滯于G2－M 期。槲皮素抑制了HL260 細(xì)胞的增殖，可逆地增加了G2／M 期的細(xì)胞數(shù)，減少了G0／G1 期的細(xì)胞數(shù)，并具有劑量依賴性。槲皮素可減少DNA的復(fù)制，導(dǎo)致細(xì)胞分裂的延遲。②促進(jìn)細(xì)胞凋亡。槲皮素顯著抑制抗凋亡蛋白Bcl－2的表達(dá)，槲皮素封閉表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸蛋白激酶活性，抑制胰腺癌細(xì)胞系MiaPaCa－2的生長(zhǎng)，導(dǎo)致其凋亡。槲皮素抗增殖作用至少部分是由于調(diào)節(jié)了EGF 介導(dǎo)的信號(hào)通路，PTK 抑制劑阻止了EGFR 信號(hào)通過(guò)，從而誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。

在試驗(yàn)中，槲皮素能阻止Lewis肺癌和乳腺癌的轉(zhuǎn)移，證實(shí)了其在機(jī)體整體系統(tǒng)中的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用，作用機(jī)制可能主要與上述的促進(jìn)細(xì)胞凋亡和阻止細(xì)胞周期相關(guān)。

我們的研究表明，槲皮素不僅對(duì)腫瘤有良好的轉(zhuǎn)移抑制作用，并且可以促進(jìn)免疫系統(tǒng)發(fā)生反應(yīng)，分化更多免疫細(xì)胞以對(duì)抗癌細(xì)胞。槲皮素較之常規(guī)化療藥物有其優(yōu)勢(shì)，將其用于不能耐受常規(guī)腫瘤化療的患者或者經(jīng)結(jié)構(gòu)改造后使其抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用均增強(qiáng)，這不失為一種可行的研制抗腫瘤藥物的新途徑。槲皮素在我國(guó)資源十分豐富，藥理作用廣泛，抗腫瘤作用也頗有希望，加強(qiáng)槲皮素的基礎(chǔ)和臨床研究，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)這個(gè)植物中普遍存在的有效成分，使之成為防治癌腫的制劑。

［1］王艷芳，王新華，朱宇同.槲皮素藥理作用研究進(jìn)展［J］.天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2003，15（2）：171－173.

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