彭 馨,袁興中*,黃華軍,崔凱龍,方振敏,曾光明 (1.湖南大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,湖南 長沙410082；2.湖南大學(xué)環(huán)境生物與控制教育部重點實驗室,湖南 長沙 410082)

漆酶的逆膠束萃取條件優(yōu)化的研究

彭 馨1,2,袁興中1,2*,黃華軍1,2,崔凱龍1,2,方振敏1,2,曾光明1,2(1.湖南大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,湖南 長沙410082；2.湖南大學(xué)環(huán)境生物與控制教育部重點實驗室,湖南 長沙 410082)

研究了生物表面活性劑逆膠束體系萃取純化漆酶的后萃的過程.在此逆膠束體系中,表面活性劑采用一種陰離子生物表面活性劑鼠李糖脂(rhamnolipid, RL),溶劑采用異辛烷.分別考察了4種不同離子種類(NaCl, NaBr, KCl和KBr)與不同濃度、4種不同助溶劑種類(正丁醇,正己醇,正庚醇及正辛醇)與不同比例、乙醇的含量以及溫度對漆酶的后萃過程的影響.結(jié)果表明,0.25mol/L KCl或0.20mol/L KBr能夠得到較好的萃取效果;在四種助溶劑中,正己醇(比例為0.5)和正庚醇(比例為0.5)效果比較好;乙醇加入量為 9%效果最優(yōu);最適宜溫度為 35℃.在上述條件下,漆酶的酶活回收率和純化倍數(shù)分別高達 90%,4.7倍.電泳分析結(jié)果進一步證實了漆酶的純化效果較好.研究證明鼠李糖脂逆膠束萃取酶類具有廣闊的應(yīng)用前景.

鼠李糖脂；逆膠束；后萃；漆酶

木質(zhì)素的分解是細胞內(nèi)酶和細胞外酶共同作用下的氧化過程,其在自然界中的降解進行困難且緩慢,對環(huán)境造成了嚴重的負擔.漆酶(Laccase)在木質(zhì)素降解的應(yīng)用中起著重要的作用.因此,研究漆酶的純化技術(shù)已成為熱點[1].在目前已經(jīng)有的漆酶純化技術(shù)中,一般仍采用等電點沉淀、鹽析、有機溶劑分級分離等方法對粗酶液進行處理,再用凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析、親和層析等方法進一步分離提純,操作步驟較為繁雜,酶的活性回收率較低,而且不易規(guī)?；a(chǎn)[2-4].因此,開創(chuàng)具有較高活性回收率,并能獲得高純度漆酶的純化方法,將推動我國木質(zhì)纖維素降解酶獲得實際應(yīng)用.

逆膠束分離純化是針對生物活性蛋白質(zhì)提出的一種液液萃取技術(shù).逆膠束是表面活性劑在非極性有機溶劑中超過臨界膠團濃度(CMC)時自組裝形成的納米尺寸的聚集體,具有良好的熱力學(xué)穩(wěn)定性[5].與傳統(tǒng)的技術(shù)相比,逆膠束萃取具有分離步驟少、操作簡易、成本較低、選擇性高和不易引起酶蛋白失活變性等諸多優(yōu)勢,在蛋白質(zhì)及酶純化方面體現(xiàn)出更大的潛力,在酶等蛋白質(zhì)的純化應(yīng)用領(lǐng)域突顯著重要意義和良好的應(yīng)用前景[6].采用生物表面活性劑(鼠李糖脂)制備的逆膠束體系可有效避免環(huán)境中化學(xué)試劑大量使用所造成的污染累積,使得工藝流程更具安全性和環(huán)境可持續(xù)性[7].

逆膠束萃取分為前萃和后萃兩個階段.目前,已經(jīng)有大量文獻報道了關(guān)于前萃的研究[8-9],而關(guān)于逆膠束萃取的后萃研究較少,特別是漆酶的后萃研究還鮮有報道.基于此,本研究擬采用鼠李糖脂構(gòu)建逆膠束體系對漆酶進行萃取純化(包括前萃和后萃),并考察離子種類和濃度,助溶劑種類和濃度以及乙醇的加入量對漆酶萃取純化后萃過程的影響,從而為漆酶的萃取純化工業(yè)推廣提供了實驗依據(jù),對酶純化的工業(yè)生產(chǎn)具有重要的意義.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 ABTS(Sigam 公司);鼠李糖脂 RL(實驗室自己制備[10]);異辛烷、正丁醇、正己醇、正庚醇、正辛醇、無水乙醇和KCl、KBr等試劑均為市售分析純.

1.1.2 儀器 紫外分光光度計(Shimadzu UV-2552,Japan);水浴恒溫振蕩器(WHY-2);超聲波清洗儀; pH計(PHS-2F,上海雷磁儀恒溫干燥箱.

1.2 方法

1.2.1 漆酶粗酶液的制備 雜色云芝C.Versicolor(ACCC 51171)購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院保藏中心.

云芝發(fā)酵培養(yǎng)基(L-1):2g/L葡萄糖,1.28g/L酒 石酸 銨 ,2g/L KH2PO4, 0.5g/L MgSO4·7H2O,0.076g/L CaCl2·7H2O, 0.001g/L 維生素 B1,1g/L Tween80, 7mL/L微量元素液,10mmol/L 醋酸緩沖溶液(pH4.5).

微量元素混合液:氨基乙酸 0.585g/L,MgSO4·7H2O 2.952g/L,MnSO4·H2O 0.5g/L,NaCI 1g/L,FeSO4·7H2O 0.1g/L,CoCI20.1g/L, CaCI20.1g/L,ZnSO4·7H2O 0.1g/L, CuSO4·5H2O 0.01g/L,KAI(SO4)2·12H2O 0.01g/L,HBO30.01g/L, NaMnO40.006g/L.

制備方法:500mL錐形瓶中裝液體發(fā)酵培養(yǎng)基100mL,高壓滅菌后接種,28℃,180r/min搖床培養(yǎng)6d.8000r/min離心10min得到粗酶液.

1.2.2 萃取 將一定量的鼠李糖脂經(jīng)超聲振蕩溶于以不同比例混合的正X醇/異辛烷的溶液中,形成逆膠束溶液.前萃是將漆酶粗酶液與逆膠束溶液等體積混合,振蕩一定的時間后以8000r/min離心10min,靜置分相,留取上層有機相.后萃是將前萃后所得的有機相和等體積的含一定離子濃度的 0.1mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液混合,振蕩40min,8000r/min離心10min,靜置分相,留取下層水相.采用紫外分光光度法分別測定所得水相中的蛋白質(zhì)含量和 Lac酶活.實驗條件與本課題組前期研究一致[11].

蛋白質(zhì)后萃率(BEE)定義:后萃水相的蛋白質(zhì)含量與前萃油相中蛋白質(zhì)含量的百分比.漆酶酶活回收率(AR)定義為:后萃水相中酶含量與初始酶液中酶含量的百分比.純化倍數(shù)(PF)為后萃水相中的比酶活與初始酶液的比酶活之比.

1.2.3 漆酶酶活測定 取 1mL待測酶液,加入2mL 0.05mmol/L的 ABTS溶液,pH=4.5,反應(yīng)3min,在 420nm 波長下測定吸光度的變化.同反應(yīng)體系做空白樣啟動反應(yīng).一個酶活力單位(U)定義為每分鐘氧化ABTS所需的酶量.

1.2.4 蛋白質(zhì)濃度的測定 水相中蛋白質(zhì)濃度采用 Folin-酚法.取 1mL樣品溶液,加入 5mL試劑甲混勻,放置10min后加入0.5mL試劑已,立即搖勻,保存 30min,然后于 500nm 處比色,以 1mL代替樣品作空白對照.測定后,可從標準曲線中查出未知樣品濃度.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同離子對后萃的影響

離子種類和濃度在逆膠束萃取技術(shù)中是一個很重要的影響因素.在酶純化中,普遍采用Na+,K+和 Ca2+探究陽離子對萃取的影響[12-14].由于Na/Ca-Cl作用和影響十分相似[6],因此本實驗采用 NaCl,NaBr,KCl和 KBr探究 Na+與 K+影響大小程度.不同離子種類和濃度對漆酶后萃的影響如圖 1所示.陽離子的種類和濃度對鼠李糖脂形成逆膠束溶液的萃取有明顯的影響.由圖 1(a)可知,當NaCl濃度為0.15mol/L時,酶活回收率和純化因子均達到最大值.雖然此時蛋白質(zhì)后萃率未達到最優(yōu)值,但綜合考慮各個參數(shù),本文采用最佳PF時的各參數(shù)為最優(yōu)條件.NaCl濃度為0.15mol/L是最優(yōu)濃度.從圖 1(b)可以看出,NaBr最優(yōu)值應(yīng)為0.25mol/L.同理由圖1(c)和圖1(d)得知,KCl和 KBr的最優(yōu)濃度為 0.25mol/L和0.20mol/L.

圖1 不同離子種類與濃度對后萃的影響Fig.1 Effect of ionic strength on backward extraction

由圖1可見,隨著4種離子濃度的增加,酶活回收率,后萃率和純化因子大致上都是呈先增加然后降低的趨勢.這一現(xiàn)象可以用雙電層理論進行解釋.當離子濃度增大時,蛋白質(zhì)與逆膠束表面之間的靜電引力減小,從而降低了酶蛋白在逆膠束中的溶解度,使之由有機相反萃取回水相[15].雙電層與離子強度之間的關(guān)系為[16]

式中:k為雙電層厚度,cm;I為離子強度, mol/L.

從式(1)可以看出隨著I的增大,逆膠束內(nèi)表面的雙電層變薄,即靜電引力隨著I的增大而減弱:另一方面,逆膠束內(nèi)表面雙電層變薄之后,減小了逆膠束內(nèi)表面極性頭之間的相互斥力,使逆膠束變小.這兩方面會使漆酶更容易從逆膠束中萃取出來[17-18].但過高的離子濃度影響蛋白質(zhì)的溶解,甚至使得蛋白質(zhì)變質(zhì)[18].

在4種離子最優(yōu)值的條件下(NaCl: 0.15mol/L,NaBr:0.25mol/L, KCl:0.25mol/L和KBr:0.2mol/L),純化倍數(shù)對比發(fā)現(xiàn),K+對后萃的影響優(yōu)于 Na+的影響.類似的實驗結(jié)果在文獻[19]中也曾出現(xiàn).

2.2 不同助溶劑對后萃的影響

采用正丁醇、正己醇、正庚醇及正辛醇等4種正構(gòu)醇作為助溶劑,分別以不同的比例加入有機相異辛烷中,探究助溶劑種類和比例對漆酶后萃過程的影響,如圖2所示.由圖2(a)可知,當正丁醇的比例為0.35時,酶活回收率達到最大值.而當其比例為 0.5時,后萃率和純化倍數(shù)均達到最大值.從圖 2(b)和圖 2(c)可以看出,正己醇和正庚醇最優(yōu)比例應(yīng)為 0.5,在此條件下,酶活回收率,后萃率和純化倍數(shù)均達到最大值.由圖 2(d)可知,正辛醇對后萃的影響不穩(wěn)定,有兩個峰值,并且酶活回收率在80%以下,后萃率不到30%,純化倍數(shù)與其他助溶劑相比也較低.正己醇體系酶活回收率達90%,純化倍數(shù)達 4.7;正庚醇體系酶活回收率達81%,純化倍數(shù)達 4.3.因此可以看出,正己醇和正庚醇比較適合作為助溶劑.

圖2 不同助溶劑種類與比例對后萃的影響Fig.2 Effect of co-solvent on backward extraction

在逆膠束體系中,助溶劑分子會插入到鼠李糖脂的分子之間,因此產(chǎn)生兩方面的影響:一是改變了鼠李糖脂的親水基之間的作用;二是使鼠李糖脂的排列變得松散.這兩方面的影響可以導(dǎo)致鼠李糖脂黏合性降低,從而增加了鼠李糖脂在有機溶劑中的溶解性[20].加入助溶劑之后,有機相能夠增溶更多的鼠李糖脂,有利于逆膠束萃取.Jolivalt等[20]研究表明,增加助溶劑的碳鏈長度會導(dǎo)致表面活性劑分子頭部集團之間的屏蔽作用降低,使得逆膠束體積變大.這一點可以從正己醇、正庚醇和正辛醇均比正丁醇更有利于逆膠束的萃取中得到證實.但同時實驗表明,正辛醇相對于正己醇和正庚醇并沒有體現(xiàn)出明顯的優(yōu)越性,這可能是因為碳鏈長度超過了合適的范圍,導(dǎo)致萃取不穩(wěn)定.

2.3 不同乙醇加入量對后萃的影響

在后萃過程中加入乙醇,會使得萃取后的分相變得相對容易,界面非常清晰[18].乙醇能夠降低界面剛性,使得蛋白質(zhì)和逆膠束內(nèi)表面之間的作用減弱,從而使得蛋白質(zhì)更容易從逆膠束中遷移出來,增加界面流動性,促進逆膠束在界面上的自由活動.同時還能減弱酶和表面活性劑極性頭基之間的靜電作用,防止蛋白質(zhì)變性.根據(jù)Mathew 等[21]提出的理論,溶劑參與構(gòu)建逆膠束的外殼,而乙醇則是進入逆膠束的水核中,從而使后萃過程變得容易.

如圖3所示,乙醇加入量(0～24%,V/V)對后萃的影響呈鐘罩型.當乙醇加入量小于 9%時,隨著乙醇的增加,酶活回收率和純化倍數(shù)都有明顯的提高,后萃率也有所增加.當乙醇加入量超過 9%時,隨著乙醇的增加,酶活回收率和純化倍數(shù)均呈下降趨勢.后萃率變化較為平緩,但當乙醇加入量超過12%時,后萃率也開始有所降低.本次實驗最佳乙醇加入量為9%.

圖3 不同乙醇加入量對后萃的影響Fig.3 Effect of ethanol on backward extraction

2.4 溫度對后萃的影響

漆酶萃取酶活回收率,后萃率和純化倍數(shù)隨溫度的變化(15～50℃)如圖4所示.從圖4可以看出,溫度對酶活回收率的影響較大,當溫度低于35℃時,酶活回收率隨著溫度的升高而增加;當溫度為 35℃時,酶活回收率達到最高值;當溫度高于 35℃時,酶活回收率隨著溫度的升高而降低.而溫度對后萃率的影響并不大,后萃率比較穩(wěn)定,在溫度為30℃時達到相對較大值.純化倍數(shù)隨溫度的變化與酶活回收率的變化比較一致,在35℃時達到最大值.綜合考慮,35℃為最佳溫度.

較低的溫度不利于逆膠束萃取,而過高的溫度會使酶活性和萃取效率降低.這一點與前人的研究結(jié)果較為一致,如Yu等[22]采用AOT逆膠束體系萃取純化酵母酶的研究、Liu等[23]采用AOT逆膠束體系純化納豆激酶的研究和Dekker等[24]采用頓巴黃銅逆膠束體系研究溫度對α-淀粉酶增溶性的研究.

圖4 溫度對后萃的影響Fig.4 Effect of temperature on backward extraction

3 結(jié)論

3.1 采用陰離子生物表面活性劑鼠李糖脂構(gòu)建逆膠束體系萃取漆酶,在后萃過程中加入不同種類與濃度的離子,最佳離子為KCl或KBr,其最佳濃度值分別為0.25mol/L和0.20mol/L.

3.2 考察了加入不同種類與比例的助溶劑對后萃的影響,確定最佳助溶劑為正己醇或正庚醇(體積均比例為0.5).

3.3 考察了不同乙醇含量對后萃的影響,結(jié)果表明,乙醇加入量 9%為最優(yōu).在最優(yōu)的條件下,酶活回收率為90%,純化倍數(shù)為4.7.

3.4 考察了不同溫對后萃的影響,結(jié)果表明35℃時酶活回收率及純化倍數(shù)均達到最大值,為最佳溫度.

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Purification progress of laccase by reversed micelle system.

PENG Xin1,2, YUAN Xing-zhong1,2*, HUANG Hua-jun1,2,CUI Kai-long1,2, FANG Zhen-min1,2ZENG Guang-ming1,2(1.College of Environmental Science and Engineering, Hunan University, Changsha 410082, China；2.Key Laboratory of Environmental Biology and Pollution Control, Hunan University, Ministry of Education, Changsha 410082, China).China Environmental Science, 2013,33(5)：904～909

Backward extraction of laccase by an innovative method, biosurfactant-based reversed micellar extraction(RME) was studied. In this reversed micelle system, rhamnolipid (RL), a kind of anionic biosurfactant, was employed and isooctane was used as solvent. Four different salts type (NaCl, NaBr, KCl and KBr) with different concentration and four different co-solvent type(n-butanol, n-hexanol, n-heptanol and n-octanol) with different ratio were added respectively in the RME. The effects of ethanol and temperature on backward extraction were studied. The experimental results showed that the impact of KCl (0.25mol/L) on backward extraction approximately equal to KBr (0.20mol/L). Optimum co-solvent was n-hexanol or n-heptanol both with the ratio of 50%. Ethanol was added in backward extraction process and the appropriate volume was 9%. The optimum temperature during backward was 35℃. The best activity recovery and purification fold were 90% and 4.7. The analysis results of SDS-PAGE further proved that laccase was successfully purified. The research indicated RL-RME has huge potential in extraction industry.

rhamnolipid；reversed micellar extraction；backward extraction；laccase

X17

A

1000-6923(2013)05-0904-06

2012-08-30

國家自然科學(xué)基金資助項目(50978087/21276069)

* 責任作者, 教授, yxz@hnu.edu.cn

彭 馨(1987-),女,內(nèi)蒙古烏海人,湖南大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院碩士研究生,研究方向為廢物資源化.