杜建中，姚 媛，文超燕

（湛江師范學院化學科學與技術學院，廣東湛江524048）

茶多酚屬于多酚類物質(zhì)，是茶葉中含有2-苯基苯并吡喃的衍生物的多酚類物質(zhì)的總稱，因其分子結(jié)構(gòu)中含有較多的還原性酚羥基而具有很強的清除體內(nèi)自由基的功能，是一種純天然的抗氧化劑，具有優(yōu)越的抗氧化能力，并具有抗癌、抗衰老、抗輻射、清除人體自由基、降血糖、降血壓、降血脂及殺菌等一系列藥理功能，在油脂、食品、醫(yī)藥、日化、化妝品、保健品及飲料等領域具有廣泛的應用前景[1-3]。我國衛(wèi)生部已批準了茶多酚天然抗氧化劑為我國的食品添加劑之一。茶飲料因風味獨特，兼有營養(yǎng)、保健功效，是清涼解渴、深受消費者歡迎的多功能飲料。因此，茶多酚含量的高低是評價茶飲料質(zhì)量的一個主要指標。茶多酚含量的測定方法主要有氧化還原滴定法[4]、可見分光光度法[5-7]、差示分光光度法[8]、三波長分光光度法[9]、重氮化-偶合分光光度法[10]紫外分光光度法[11]、流動注射法[12-14]、離子電極法[15]、電化學法[16]、原子吸收法[17]、高效液相色譜法[18]等。根據(jù)茶飲料的組成特點，本實驗采用高聚物水溶液對茶飲料中的茶多酚進行了定量萃取，并利用分光光度法對茶多酚含量進行了定量測定，取得了較滿意的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沒食子酸丙酯 國藥集團化學試劑有限公司；三羥甲基氨基甲烷 珠海市華成達化工有限公司；酒石酸鉀鈉 天津市大茂化學試劑廠；硫酸亞鐵 天津市致遠化學試劑有限公司；聚乙二醇-4000 國藥集團化學試劑有限公司；硫酸銨 天津市大茂化學試劑廠；所有實驗用水 均為去離子水；試劑 均為分析純；勁涼冰紅茶、檸檬茶、綠茶、冰醇茉莉、冰紅茶 市售。

UV-2550紫外可見分光光度計 日本島津制作所；精密pH計 廣州廣一科學儀器有限公司；分析天平 上海濟成分析儀器有限公司；DT100電子天平常熟市雙杰測試儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的配制 沒食子酸丙酯標準儲備液：準確稱取0.250g沒食子酸丙酯，用水溶解后定容至250mL，其濃度為4.71mmol·L-1，實驗時稀釋至0.471mmol·L-1；酒石酸亞鐵溶液：稱取七水合硫酸亞鐵0.1g，四水合酒石酸鉀鈉0.5g，溶于水并稀釋至100mL（避光，現(xiàn)配現(xiàn)用）；300g·L-1的聚乙二醇-4000溶液：稱取150g聚乙二醇-4000，溶解、稀釋至500mL，移至棕色瓶避光保存；0.2mol·L-1三羥甲基氨基甲烷溶液：稱取4.8g三羥甲基氨基甲烷，加水溶解至200mL，實驗時，調(diào)至所需pH。

1.2.2 吸收曲線的繪制 準確移取10.00mL 0.471mmol·L-1的沒食子酸丙酯標準溶液置于60mL的分液漏斗中，加入5.0mL 300g·L-1聚乙二醇-4000，搖勻后加入4.0g（NH4）2SO4固體，振蕩2min，靜置。待兩相分層清楚后，棄去下層水相，將上層高聚物相轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，潤洗分液漏斗3次，洗液并入容量瓶中。加入5.0mL pH8.0三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液，5.0mL酒石酸亞鐵溶液，定容，搖勻。10min后，以未加沒食子酸丙酯的高聚物萃取相的試劑空白為參比溶液，400～800nm范圍進行波長掃描，繪制吸收曲線。

1.2.3 緩沖溶液的選擇 準確移取10.00mL 0.471mmol·L-1沒食子酸丙酯標準溶液于4個分液漏斗中，按照“1.2.2”操作萃取分離。分別加入pH8.0的磷酸鹽緩沖溶液、硼砂緩沖溶液、三乙醇胺緩沖溶液、三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液，5.0mL酒石酸亞鐵溶液，定容，搖勻。

1.2.4 緩沖溶液的pH的影響 準確移取10.00mL 0.471mmol·L-1沒食子酸丙酯標準溶液于8個分液漏斗中，按照“1.2.2”操作萃取分離。分別加入5.0mL pH為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液，5.0mL酒石酸亞鐵溶液，定容，搖勻。分別以pH為7.0、8.0、8.5、9.0的未加沒食子酸丙酯的高聚物萃取相的試劑空白為參比溶液，在518nm測定其吸光度值。

1.2.5 緩沖溶液用量的影響 準確移取10.00mL 0.471mmol·L-1沒食子酸丙酯標準溶液于分液漏斗中，按照“1.2.2”操作萃取分離后，分別加入pH8.0的三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、7.0、9.0mL，酒石酸亞鐵溶液5.0mL，定容，搖勻。在518nm分別測定其吸光度。

1.2.6 顯色液用量的影響 準確移取0.471mmol·L-1沒食子酸丙酯標準溶液10.00mL，按照“1.2.2”操作萃取分離。加入pH8.0的三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液2.0mL，分別加入酒石酸亞鐵溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、7.0、9.0mL，定容，搖勻。以未加沒食子酸丙酯的高聚物萃取相的試劑空白為參比溶液，在518nm分別測定其吸光度。

1.2.7 顯色時間的確定 準確移取0.471mmol·L-1的沒食子酸丙酯標準溶液10.00mL，按照“1.2.2”操作萃取分離。加入酒石酸亞鐵溶液3.0mL，pH8.0的三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液2.0mL，定容，搖勻。以未加沒食子酸丙酯的高聚物萃取相的試劑空白為參比溶液，在518nm測定顯色時間為2、5、7.5、10、15、20、25min時溶液的吸光度。

1.2.8 萃取率的測定 為了解聚乙二醇-4000對茶飲料中茶多酚的萃取效率，移取茶飲料5.00mL于60mL分液漏斗中，加入300g·L-1聚乙二醇-4000溶液5.0mL，搖勻后加入4.0g（NH4）2SO4固體，振蕩2min，靜置。待兩相分層后，將萃余水相轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，加入pH8.0的三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液2.0mL，酒石酸亞鐵溶液3.0mL，定容，搖勻。10min后，以未加茶飲料的萃余水相的試劑空白為參比溶液，在400～800nm范圍掃描其吸收曲線。

1.2.9 標準曲線的繪制 分別準確移取不同體積的0.471mmol·L-1沒食子酸丙酯標準溶液于60mL的分液漏斗中，加水至約10mL，加入5.0mL 300g·L-1聚乙二醇-4000，搖勻后加入4.0g（NH4）2SO4固體，振蕩2min，靜置。待兩相分層清楚后，棄去下層水相，將上層高聚物相轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，潤洗分液漏斗3次，洗液并入容量瓶中，加入pH8.0的三羥甲基氨基甲烷緩沖液2.0mL，酒石酸亞鐵溶液3.0mL，定容，搖勻，配制成沒食子酸丙酯系列標準顯色溶液。10min后，用1cm比色皿，以未加沒食子酸丙酯的高聚物萃取相的試劑空白作為參比，在518nm處測定吸光度，繪制吸收曲線。

1.2.10 樣品的測定 準確移取4.00mL待測樣品液于60mL分液漏斗中，按“1.2.2”步驟操作萃取分離。加入pH8.0的三羥甲基氨基甲烷緩沖液2.0mL，酒石酸亞鐵溶液3.0mL，定容，搖勻，在518nm處測定吸光度。代入線性方程，計算溶液中茶多酚的濃度，并求出樣品中茶多酚的含量。

1.2.11 茶多酚質(zhì)量濃度的計算 換算公式如下：

式中，C為根據(jù)溶液吸光度測得樣品中茶多酚的物質(zhì)的量濃度；V為樣品體積（1升），M沒食子酸丙酯為沒食子酸丙酯的摩爾質(zhì)量；1.5為換算因子。

2 結(jié)果與討論

2.1 測定條件的確定

2.1.1 測定波長的確定 由吸收曲線可知，在pH8.0的三羥甲基氨基甲烷溶液中，沒食子酸丙酯與酒石酸亞鐵形成的絡合物在518nm處有最大吸收，故選擇518nm為實驗的測定波長。

圖1 吸收曲線Fig.1 Absorption curve

2.1.2 緩沖溶液的確定 磷酸鹽、硼砂會使有機相產(chǎn)生渾濁，對檢測不利；三乙醇胺能與沒食子酸丙酯產(chǎn)生顏色反應，生成桃紅色物質(zhì)，對實驗的檢測產(chǎn)生影響；三羥甲基氨基甲烷無任何肉眼可見的不良現(xiàn)象，故選擇其為緩沖溶液。

圖2 緩沖溶液pH影響Fig.2 Effect of pH of the buffer solutions

2.1.3 緩沖溶液的pH及其用量確定 酸度對顯色反應的影響很大，溶液酸度直接影響著金屬離子、顯色劑的存在形式和有色絡合物的組成、穩(wěn)定性等。很多顯色劑本身就是酸堿指示劑，酸度不同時，它們的顏色不同，可能造成顯示劑顏色與絡合物的顏色相近而影響測定。由圖2可知，在其他條件相同的情況下，沒食子酸丙酯與酒石酸亞鐵形成的絡合物在pH7.5～8.5時吸光度最大，故實驗選擇三羥甲基氨基甲烷溶液pH為8.0。由圖3可知，在實驗條件下，三甲羥基甲氨基烷溶液用量在1mL以上時，溶液的吸光度基本不變，為保證溶液有足夠的緩沖能力，實驗選擇三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液用量為2.0mL。

圖3 緩沖溶液用量的影響Fig.3 Effect of the buffer solutions

2.1.4 顯色劑用量及顯色時間的確定 為保證顯色反應進行完全，加入過量的顯色劑是必要的，但過多的顯色劑不僅會造成試劑的浪費，還可能影響顯色效果。由圖4可知，加入酒石酸亞鐵溶液在2.0～3.5mL時，溶液的吸光度最大，實驗選擇酒石酸亞鐵溶液用量為3.0mL。在顯色反應中，時間包括兩個含義，顯色時間和穩(wěn)定時間，顯示時間太短顯色反應可能不完全，顯示時間太長造成實驗用時延長。由圖5可知，本實驗顯色時間8min以后，溶液的吸光度基本穩(wěn)定不變，實驗選擇顯示反應時間10min。

圖4 顯色劑用量的影響Fig.4 Effect of color reagent

圖5 顯色時間的影響Fig.5 Effect of color reaction times

2.2 萃取率的測定

實驗重要環(huán)節(jié)之一是將茶飲料中的茶多酚萃取至高聚物相，萃取效率的高低對測定結(jié)果有很大的影響，通過在萃余水相加入pH8.0三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液和酒石酸亞鐵溶液后，觀察其顯色情況，若萃余水相中含有茶多酚，酒石酸亞鐵將與茶多酚發(fā)生顯色反應，在測定波長下產(chǎn)生吸收，萃余水相中茶多酚含量越高吸收越大，利用萃余水相的吸收曲線可判斷萃取效率的高低。由圖6可知，茶飲料的萃余水相中加入酒石酸亞鐵，在400～700nm波長范圍沒有吸收，說明茶飲料中的茶多酚已全部轉(zhuǎn)移至聚乙二醇-4000相。

圖6 萃余水相的吸收曲線Fig.6 Absorption curve of aqueous phase

2.3 標準曲線的繪制

測定出系列標準溶液的吸光度，以吸光度A為縱坐標，沒食子酸丙酯的濃度C（mmol·L-1）為橫坐標繪制標準曲線，見圖7，其線性方程為：A=3.1106C-0.0056，R2=0.9999。進一步實驗，沒食子酸丙酯在0.004～0.4mmol·L-1濃度范圍內(nèi)，具有良好的線性關系。

2.4 樣品測定及精密度實驗

對市場上銷售的5種茶飲料，按“1.2.10”方法平行測定5次，測定結(jié)果見表1。

相對標準偏差數(shù)據(jù)顯示，該方法測定的數(shù)據(jù)具有較高的精密度，RSD范圍為1.0%～3.2%。

表1 樣品測定及精密度實驗（n=5）Table 1 Determination of the samples and test of precision（n=5）

表2 樣品回收率實驗（n=5）Table 2 Rate of recovery results（n=5）

圖7 標準曲線Fig.7 Standard curve

2.5 回收實驗

分別準確移取勁涼冰紅茶和冰醇茉莉4.00mL各5份于60mL的分液漏斗中，加入一定量沒食子酸丙酯標準溶液，加水至10mL，按“1.2.10”操作，測定吸光度，作加標回收實驗，其回收率在92.4%～103.5%，說明方法具有較高的準確度。結(jié)果見表2。

3 結(jié)論

實驗證明，利用水溶性高聚物可將茶飲料中的茶多酚全部轉(zhuǎn)移至聚乙二醇-4000相中，達到了從茶飲料中定量提取茶多酚，減少茶飲料中其他成分對茶多酚測定干擾的目的。在pH8.0的三羥甲基氨基甲烷緩沖液中，以酒石酸亞鐵為顯色劑，利用分光光度法實現(xiàn)了對茶飲料中茶多酚含量的定量測定。該方法操作簡單方便，方法可靠，準確度較高，且使用的萃取劑無毒、不揮發(fā)，避免了使用有機溶劑為萃取劑進行操作時對實驗者身心健康的傷害，為茶飲料中茶多酚的定量測定提供了較理想的分析方法。

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