許本波，謝伶俐，趙福永，田志宏

(長江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

自從1975年Edwen Southern提出DNA印漬技術(shù)后，分子雜交技術(shù)迅猛發(fā)展，廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)和基因工程的研究。當(dāng)前，分子雜交技術(shù)是分子生物學(xué)和基因工程教學(xué)、科研中一項最基本的但又非常重要的實驗技術(shù)，廣泛應(yīng)用于基因表達、轉(zhuǎn)基因檢測、分子標(biāo)記等方面的研究。

分子雜交的主要流程為轉(zhuǎn)膜、探針標(biāo)記、雜交和顯影。其中，轉(zhuǎn)膜過程簡單，成本較低。探針有放射性探針和非放射性探針兩大類，在早期的研究中，放射性同位素是應(yīng)用最多的一類探針標(biāo)記物，其最大的優(yōu)點是具有較高的特異性和靈敏性，缺點是易造成放射性污染。近年來隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，非同位素標(biāo)記方法得到了廣泛運用。目前探針標(biāo)記法主要有隨機引物延伸法、切刻平移法、末端標(biāo)記法、PCR法、熒光標(biāo)記法［1－6］等。雖然有多種探針標(biāo)記的方法，但都存在或多或少缺點，要么標(biāo)記效率低，要么標(biāo)記成本昂貴。但在本科生教學(xué)過程中，只能選用安全、簡單的探針標(biāo)記方法，因此常用Dig標(biāo)記方法。但成本高昂，特別是對于一些地方學(xué)校，由于教學(xué)經(jīng)費緊張導(dǎo)致壓縮實驗規(guī)模或簡化實驗過程，因此迫切需要發(fā)展高效、快速、低成本、簡捷的實驗方法。對于Southern雜交實驗，需要開發(fā)低成本、簡捷和安全的DNA探針標(biāo)記方法。

目前，最常用的探針標(biāo)記方法為大腸桿菌Klenow片段隨機引物延伸標(biāo)記法和PCR標(biāo)記法。前者相對成本較低，但是效率低下，需要的DNA模板量比較大，學(xué)生難以掌握。PCR法合成探針效率高、特異性較好，需要的DNA量少，但它也存在價格昂貴、成本較高的缺點，一般一次標(biāo)記需要250.00元人民幣左右。而其昂貴的主要原因之一是探針標(biāo)記的酶的價格比較高。因此，有人提出了一種利用Taq DNA polymerase進行放射性探針標(biāo)記的方法［7］，該方法比較適合危險的同位素標(biāo)記，不適合現(xiàn)在比較公認的比較安全的地高辛標(biāo)記方法。筆者在基因工程研究和基因工程的教學(xué)實踐中，從提高安全性，降低實驗成本，提高效率的角度，對southern雜交程序中探針標(biāo)記的方法進行了改進，以求其更好地用于基因工程教學(xué)。

1 DNA探針標(biāo)記方法

1.1 常規(guī)的探針標(biāo)記方法

1)DNA的缺口平移法:

該方法利用DNA聚合酶I將標(biāo)記的dNTP摻入到新合成的DNA鏈中，從而合成DNA探針。其基本原理是首先用適當(dāng)濃度的DNA酶I在DNA探針分子的一條鏈上打開缺口，缺口處形成3’羥基末端;利用大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ5’→3外切酶活性，將缺口處5’端核苷酸依次切除;與此同時，在大腸桿菌DNA聚合酶I的5’→3’聚合酶活性的催化下，以另一條DNA鏈為模板，以dNTP為原料，順序?qū)NTP連接到切口的3’羥基上，重新合成一條互補鏈，從而使缺口沿著互補DNA鏈移動，原料中含有的標(biāo)記核苷酸因此替代原DNA分子上的部分核苷酸而摻入到新合成的DNA鏈中，從而獲得標(biāo)記的DNA探針。此方法的缺點是需要較多的DNA模板(＞200 ng)，且標(biāo)記效率較低。

2)DNA的隨機引物法:

這種方法是使用寡核苷酸隨機引物，標(biāo)記的dNTP和Klenow片段來合成新的標(biāo)記DNA片段。其主要原料是利用短的隨機引物有較大的與模板的結(jié)合幾率，利用Klenow片段5’→3’聚合酶活性和標(biāo)記的dNTP來合成新鏈，從而合成新的標(biāo)記鏈。由于在反應(yīng)過程中加入的DNA片段不被降解，故在隨機引物反應(yīng)中加入的DNA可少于200 ng，甚至10 ng也能有效地標(biāo)記，DNA片段的大小不影響標(biāo)記的結(jié)果。標(biāo)記物沿所加入的全長DNA被均等地摻入，標(biāo)記的探針可以直接使用而不需要去除未摻入的核苷酸;單鏈雙鏈DNA都可作為隨機引物標(biāo)記的模板。但缺點是對DNA純度要求相對較高，標(biāo)記效率相對較低。

1.2 改進的探針標(biāo)記方法及結(jié)果分析

1.2.1 探針標(biāo)記方法

提取質(zhì)粒DNA，并測量其濃度。參照普通PCR反應(yīng)體系，配置探針標(biāo)記的體系，將其中的dNTPs換成Dig標(biāo)記的dNTPs，具體反應(yīng)體系見表1?；靹蚝蟾采w1滴礦物油，轉(zhuǎn)到已預(yù)熱到94℃的PCR儀上進行擴增，擴增程序為:94℃預(yù)變性2 min，40個循環(huán)包括 94℃變性1 min，62℃退火1 min，72℃延伸1 min，循環(huán)完畢后72℃保溫10 min。反應(yīng)結(jié)束后取2 μL PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳檢測。

表1 探針標(biāo)記的PCR反應(yīng)體系

1.2.2 雜交方法

用CTAB法提取甘藍型油菜基因組 DNA［8］，用限制性內(nèi)切酶 EcoRI、SacI和 XbaI分別酶切甘藍型油菜基因組DNA，酶切產(chǎn)物用酚－氯仿法純化。電泳，轉(zhuǎn)膜，雜交檢測按照參考文獻［9］和DIG Nucleic Acid Detection Kit說明書進行。

1.2.3 改進方法的結(jié)果分析

選用EcoRI、SacI、XbaI酶切甘藍型油菜基因組DNA(基因中不具這三個酶的酶切位點)，電泳檢測發(fā)現(xiàn)酶切產(chǎn)物smear重心在4～6 kb之間，表明酶切比較成功(圖1)，可以用于下一步實驗。

把標(biāo)記管和對照管產(chǎn)物分別進行電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)標(biāo)記管產(chǎn)物電泳時出現(xiàn)一條大約750 bp的亮帶，而對照管產(chǎn)物電泳出現(xiàn)一條大約500 bp的亮帶(圖2)，符合預(yù)測的大小。標(biāo)記的探針由于在標(biāo)記的時候摻雜了Dig，電泳檢測時導(dǎo)致遷移速率比沒有摻雜Dig的對照慢。標(biāo)記的探針條帶電泳比對照慢，表現(xiàn)似一條750 bp條帶，表明探針標(biāo)記成功。

圖1 基因組酶切

圖2 探針標(biāo)記

圖3 雜交結(jié)果

雜交顯色后發(fā)現(xiàn) EcoRI、SacI、XbaI的酶切產(chǎn)物和探針雜交后都出現(xiàn)了明亮的條帶(如圖3所示)，表明用該方法標(biāo)記的探針可以用于雜交實驗。

2 討論

雖然探針標(biāo)記的方法有很多種，但都存在種種不足，而且各公司的標(biāo)記試劑盒都比較昂貴。隨機引物延伸法、切刻平移法標(biāo)記效率相對比較低［10－11］，要求的膜板DNA的量和純度也比較高，而PCR法標(biāo)記采用的是專一的標(biāo)記酶，存在價格高，酶容易失活的缺點。用普通的Taq酶代替標(biāo)記酶，雖然擴增效率可能沒有標(biāo)記酶好，但由于Taq酶的穩(wěn)定性比較好，可以通過延長PCR反應(yīng)過程中的延伸時間，增加循環(huán)次數(shù)而改良。同時，增加了循環(huán)數(shù)，可以最大限度地利用Dig Mix，使其完全消耗，從而提高探針的標(biāo)記效率。

在教學(xué)和科學(xué)研究中，用普通的Taq酶代替專一的標(biāo)記酶，得到完全可以用于雜交實驗的探針。而且在標(biāo)記實驗中，只需要購買DIG Labeling，其他的都為常規(guī)試劑，節(jié)省了實驗成本，特別適合于教學(xué)經(jīng)費不足但又必須開設(shè)的本科生基因工程實驗教學(xué)。Dig標(biāo)記無毒，安全性好，PCR方法快速、簡便，適合大規(guī)模的學(xué)生實驗。

Taq酶探針標(biāo)記法相對其他標(biāo)記方法，具有如下優(yōu)點:廉價、快速，步驟簡便;探針標(biāo)記效率高，可以用于常規(guī)的Southern、Northern及點雜交，而且需要的膜板量少;采用基因特異引物，標(biāo)記片段特異性高，標(biāo)記片段大小一致;Taq酶的熱穩(wěn)定性好，不易變性，易于保存。

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