錢康琦，孫玉明*，詹秀琴

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210029;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,江蘇 南京210046)

骨骼系統(tǒng)的發(fā)育異常導(dǎo)致許多疾病，如骨質(zhì)疏松、骨關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。骨質(zhì)疏松癥是以骨量減少，骨組織的顯微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，并伴隨骨質(zhì)脆性增加和骨折危險(xiǎn)性升高的一類全身性骨骼疾病。以往的研究[1-2]證實(shí)了葛根素具有改善骨質(zhì)疏松的作用，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。近年來(lái),隨著分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展，Smads蛋白家族中的Smad 2/3信號(hào)蛋白受到越來(lái)越多的關(guān)注，而且此類研究尚不多見，因此，從這條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑研究骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)理是一個(gè)新的切入點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)擬采用成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法，探討葛根素對(duì)成骨細(xì)胞TGF-β1及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Smad 2/3蛋白表達(dá)的影響。在分子生物學(xué)層面，通過(guò)蛋白免疫印跡雜交(Western Bloting)法進(jìn)一步研究觀察TGF-β1/Smad信號(hào)通路在葛根素防治骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)，新生24 h小鼠, 均由浙江省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。動(dòng)物合格證：SCXK(浙)2008-0033。

1.1.2 藥物 葛根素:購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110752-200912，20 mg/支，純度為96.0%，性狀為白色粉末，干燥密閉保存。

1.1.3 主要試劑 胎牛血清(GIBCO，USA)，DMEM培養(yǎng)基(Hyclone)，含EDTA的0.25%胰蛋白酶(WISENT BIOCENTER)，磷酸鹽緩沖液(PBS)及Ⅱ型膠原酶(Gibco)，四唑鹽MTT(Amresco)，二甲基亞砜DMSO(Sigma)，內(nèi)參一抗(rabbit β-Actin)(Immunoway)，內(nèi)參二抗(IgG-HRP)(Jackson)，全蛋白抽提試劑盒，5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒，10×Tris-甘氨酸電泳緩沖液，10×電轉(zhuǎn)移緩沖液，WB抗體清除緩沖液，WB封閉液，顯色液，定影液。

1.1.4 主要儀器 高速冷凍離心機(jī)(Sigma)，CO2培養(yǎng)箱(Sanyo，USA)，超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠產(chǎn)品)，三洋超低溫冰箱(Japan)，三用電熱恒溫箱(江蘇淮陰醫(yī)療器械廠)，隔熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)，電熱鼓風(fēng)干燥箱(南京實(shí)驗(yàn)儀器廠)，倒置相差顯微鏡(Nikon)，Western電泳儀(Bio-Rad，USA)，PVDF膜(PALL), X光膠片(上海申貝感光材料廠)，多用脫色搖床(江蘇金壇市正基儀器廠)，振蕩器(上海滬西分析儀器廠)，微量加樣器(Eppendorf)，低溫冰箱(Japan)，全自動(dòng)酶標(biāo)光度計(jì)(Bio-Rad,USA)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 采用酶消化法選取新生小鼠(24 h)顱蓋骨分離得到成骨細(xì)胞。先將胎鼠20只75%乙醇中浸泡10 min；無(wú)菌切下顱蓋骨置于D-Hanks液內(nèi);清除骨膜、血管等結(jié)締組織,用D-Hanks液洗凈顱蓋骨5～6次，剪成小骨片(1 mm3)，先后于0.25%胰蛋白酶溶液及0.1%Ⅱ型膠原酶溶液中，在恒溫37 ℃振蕩消化，并重復(fù)1次。將含細(xì)胞的消化液在1 000 r/min下離心10 min，吸去上清液，沉淀的細(xì)胞團(tuán)塊用培養(yǎng)液洗2次,制成細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶，每瓶接種細(xì)胞約2×104/mL，5%CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h換液1次，直至80%細(xì)胞融合(約2～3 d)，常規(guī)消化細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 葛根素干預(yù)液的制備 將葛根素對(duì)照品先于DMSO中充分溶解后,于無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾除菌,使用前加入無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液并進(jìn)一步稀釋成為0.01 μg/mL、0.1 μg/mL、1 μg/mL 3種實(shí)驗(yàn)所需濃度的干預(yù)液，用不含葛根素的無(wú)血清培養(yǎng)液做為對(duì)照組，4 ℃冰箱保存，備用。

1.2.3 MTT法檢測(cè)葛根素對(duì)成骨細(xì)胞增殖促進(jìn)率 取第3代成骨細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn),用含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液。細(xì)胞計(jì)數(shù)后,將成骨細(xì)胞濃度調(diào)整為1×104個(gè)/mL濃度接種于一次性96孔培養(yǎng)板中,每孔180 μL，培養(yǎng)24 h后加入不同濃度的葛根素溶液，分別為0.01、0.1、1 μg/mL及空白對(duì)照組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，每孔加藥20 μL，空白對(duì)照組不加葛根素，加入相同體積的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基。加藥分別培養(yǎng)24、48、72 h后，避光條件下，每孔加入20 μL MTT(濃度5 mg/mL)，孵育4～6 h后，小心吸棄孔內(nèi)上清培養(yǎng)液,每孔加入150 μL DMSO，振蕩10min使結(jié)晶物充分溶解。在酶標(biāo)儀(波長(zhǎng)490 nm)上測(cè)定各孔吸光度值(OD)，以空白對(duì)照組為基準(zhǔn)計(jì)算成骨細(xì)胞不同時(shí)間的相對(duì)增殖率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 Western Bloting法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 各組成骨細(xì)胞用葛根素干預(yù)液及空白對(duì)照組，處理24 h后，提取各組細(xì)胞總蛋白，并用BCA法進(jìn)行蛋白定量。-20 ℃保存。取各組成骨細(xì)胞樣本70 μg，進(jìn)行SDS-PAGE聚丙烯胺凝膠電泳，將分離后的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，4 ℃封閉，過(guò)夜后按約0.1 mL/cm2的量加入封閉液和適量一抗抗體TGF-β1、Smad2、Smad3(1∶500)搖床搖蕩孵育(4 ℃，過(guò)夜)。TBST漂洗濾膜4次,每次10 min。將膜與HRP結(jié)合的二抗(二抗用封閉液稀釋1∶5 000)室溫下?lián)u蕩孵育2 h，然后用TBST充分洗膜，漂洗4次，每次10 min。將顯影液加于PVDF膜上,室溫放置1 min。用保鮮膜將膜包好(盡量避免氣泡)。暗室中迅速將膜蛋白貼在X光膠片上曝光,洗片機(jī)中顯影、洗像。調(diào)整曝光時(shí)間，直至出現(xiàn)最佳條帶。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 MTT檢測(cè)結(jié)果 見表1。

2.2 Western Bloting結(jié)果 見圖1、圖2、圖3。

表1 葛根素對(duì)成骨細(xì)胞增殖的促進(jìn)(±s)

圖1 各實(shí)驗(yàn)組TGF-β1蛋白表達(dá)含量的變化

圖2 各實(shí)驗(yàn)組Smad2蛋白表達(dá)含量的變化

圖3 各實(shí)驗(yàn)組Smad3蛋白表達(dá)含量的變化

3 討論

成骨細(xì)胞在分化、增殖過(guò)程中受到各種分子機(jī)制的信號(hào)通路的調(diào)節(jié)[3]。本實(shí)驗(yàn)研究則是基于TGF-β1這一信號(hào)傳導(dǎo)通路的活化作用，其中涉及其相關(guān)蛋白Smad2和Smad3的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞,并且取其第3代采用噻唑藍(lán)還原法(MTT)測(cè)定葛根素對(duì)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)率。數(shù)據(jù)表明，不同濃度及不同時(shí)間作用下，葛根素對(duì)于成骨細(xì)胞增殖均有促進(jìn)作用，其中，在24 h各干預(yù)組的活化作用最為明顯，并且各組對(duì)于成骨細(xì)胞促增殖呈現(xiàn)出濃度依賴性。

在促成骨細(xì)胞分化中存在著TGF-β1/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在復(fù)雜的骨代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，已有研究[4-5]證實(shí)該信號(hào)通路在骨重建中發(fā)揮重要作用?；钚缘腡GF-β1既具有刺激骨形成，又具有抑制骨吸收的雙重作用,是骨代謝重要的偶聯(lián)調(diào)節(jié)因子[6]。體內(nèi)研究[7]表明：在成骨細(xì)胞的細(xì)胞膜上有TGF-β1的特異性受體，作用于成骨細(xì)胞，調(diào)節(jié)其增殖和分化，同時(shí)它們之間相互作用，從而調(diào)節(jié)骨形成。在TGF-β1促成骨細(xì)胞分化過(guò)程中，其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Smad2、Smad3呈現(xiàn)出由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)位，介導(dǎo)TGF-β1信號(hào)。有實(shí)驗(yàn)[8]表明Smad3基因剔除引起成骨細(xì)胞數(shù)目減少，破骨細(xì)胞數(shù)目增多,導(dǎo)致小鼠骨小梁稀疏、骨密度降低,發(fā)生骨質(zhì)疏松。Smad 2/3是TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中特異的、起瓶頸作用的重要因子，在骨的形成、重塑和維持過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[9]。通過(guò)Smad 2/3的呈遞作用給TGF-β1受體復(fù)合物，穩(wěn)定了先前形成DNA-蛋白復(fù)合體及其功能，然后通過(guò)與含重要轉(zhuǎn)錄激活因子或阻礙因子的高分子復(fù)合物結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄[10]。當(dāng)TGF-β1/Smad信號(hào)級(jí)鏈活化后，Smad2、Smad3可能通過(guò)不同的Smads信號(hào)復(fù)合物的形成來(lái)選擇性調(diào)節(jié)TGF-β1 依賴的特異基因的表達(dá)[11]。

蛋白免疫印跡雜交(Western Bloting)技術(shù)是利用抗原及抗體之間的特異性相互識(shí)別和結(jié)合，實(shí)現(xiàn)目的蛋白的檢測(cè)和初步定量。Western Bloting實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TGF-β1及Smad2/3的蛋白表達(dá)情況相對(duì)于內(nèi)參β-action有明顯差異，各實(shí)驗(yàn)組總灰度值比值相比于空白DMEM組隨著干預(yù)液的濃度不斷升高呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)(P<0.05)。Smad 2/3的表達(dá)幾乎與TGF-β1的表達(dá)平行，呈現(xiàn)出濃度依賴性。各給藥組在蛋白表達(dá)方面，不同程度上調(diào)TGF-β1與Smad 2/3陽(yáng)性表達(dá)水平，有一定的量效關(guān)系，高、中劑量組明顯優(yōu)于低劑量組。

另外,本研究從TGF-β1/Smad信號(hào)通路提示了葛根素對(duì)骨質(zhì)疏松癥的治療作用。葛根素對(duì)骨量保持具有正向意義，能夠增強(qiáng)成骨細(xì)胞分化的敏感性；葛根素亦可通過(guò)調(diào)控此信號(hào)通路影響成骨細(xì)胞的增殖和分化，達(dá)到防治骨質(zhì)疏松的目的。在分子生物學(xué)層面，葛根素調(diào)節(jié)和影響細(xì)胞內(nèi)源性基因TGF-β1/Smad信號(hào)表達(dá)揭示了成骨細(xì)胞增殖分化的相關(guān)分子機(jī)制,又為其促進(jìn)骨質(zhì)疏松的治療提供了新的依據(jù)。

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