謝服役 孫琦 吳巧萍

參考方法測(cè)定血清葡萄糖的測(cè)量不確定度評(píng)價(jià)

謝服役 孫琦 吳巧萍

目的 探討參考實(shí)驗(yàn)室對(duì)測(cè)量不確定度的評(píng)定方法和程序。 方法 應(yīng)用美國疾病與預(yù)防控制中心推薦的血清葡萄糖測(cè)定參考方法對(duì)血清樣本進(jìn)行測(cè)定，分析整個(gè)過程中各不確定度分量的來源，按A、B兩類不確定度的計(jì)算方式對(duì)各分量分別進(jìn)行評(píng)定，計(jì)算合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度。最后取95%置信區(qū)間，計(jì)算出擴(kuò)展不確定度。 結(jié)果 血清葡萄糖的平均濃度為15.20mmol/L，合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.14mmol/L，取95%置信區(qū)間，包含因子k=2，則擴(kuò)展不確定度U為0.29mmol/L。 結(jié)論 參考實(shí)驗(yàn)室的測(cè)量不確定度與傳統(tǒng)的測(cè)量誤差相比，更能反映測(cè)量的水平，對(duì)臨床檢驗(yàn)工作有一定的指導(dǎo)意義，也為采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量的，如血清葡萄糖、血清總膽紅素和血清尿素等參考方法測(cè)量結(jié)果的不確定度評(píng)價(jià)提供一定的科學(xué)依據(jù)。

參考方法 血清葡萄糖 測(cè)量不確定度 標(biāo)準(zhǔn)不確定度和擴(kuò)展不確定度

【 Abstract】 Objective To explore the method and procedure for evaluation of measurement uncertainty of serum glucose in reference laboratory. Methods The concentration of glucose in serum samples was measured by the reference method which was recommended by the U.S.Centers for Disease Control and Prevention (CDC),and the sources of each uncertainty component in whole procedure of analysis were identified.The evaluation of uncertainty components was processed by using two types of method,then a combined standard uncertainty was calculated;finally,an expanded uncertainty was given according to 95% confidence interval. Results The average concentration of glucose was 15.20 mmol/L,the related combined standard uncertainty was 0.14 mmol/L and the expanded uncertainty(U)was 0.29 mmol/L(the desired level of confidence of approximately 95%, the coverage factor k=2). Conclusion Compared to the traditional measurement errors,the measurement uncertainty in reference laboratory may reflect the measurement ability better,and which would be helpful for evaluation of measurement uncertainty in reference laboratory.

測(cè)量不確定度是表征合理的賦予被測(cè)量之值的分散性，與測(cè)量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)。它是以參數(shù)形式定量表示無法修正的那部分誤差的范圍，是用來表征被測(cè)量之值所處區(qū)間的一種評(píng)定。在不確定度評(píng)估過程中，要對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)的所有步驟進(jìn)行討論，找出不確定度來源，并進(jìn)行計(jì)算，由數(shù)據(jù)可以清晰得出不確定度分量中起主要作用的因素。通過分析不確定度，把測(cè)試分析誤差控制在允許限度內(nèi)，保證測(cè)試結(jié)果有一定的精密度和準(zhǔn)確度，使分析數(shù)據(jù)在給定的置信水平內(nèi)，有把握達(dá)到所要求的質(zhì)量。當(dāng)發(fā)現(xiàn)質(zhì)量控制數(shù)據(jù)將超出預(yù)先確定的判據(jù)時(shí)，應(yīng)采取有計(jì)劃的措施來糾正出現(xiàn)的問題，同時(shí)采取措施防止報(bào)告錯(cuò)誤的結(jié)果。

為了提高臨床檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的可比性，促進(jìn)臨床診斷和治療的有效性，歐盟通過體外診斷用品導(dǎo)則（Directive 98/79/EC）要求體外診斷用品的量值溯源性：“校準(zhǔn)物質(zhì)/質(zhì)控物質(zhì)定值的溯源性必須通過已有的高一級(jí)的參考方法/參考物質(zhì)予以保證”。我國關(guān)于體外診斷醫(yī)療器械生物樣品中量的測(cè)量校準(zhǔn)品和控制物質(zhì)賦值的計(jì)量學(xué)溯源性（GE/T 21415-2008/ISO 17511:2003）于2008-09開始實(shí)施。ISO對(duì)溯源性的定義中明確指出比較鏈中每一步都同時(shí)給出該值的不確定度。因此，如何評(píng)價(jià)參考方法測(cè)量結(jié)果的不確定度成為一個(gè)亟待解決的問題。本文按照美國疾病與預(yù)防控制中心（Centers for Disease Control and Prevention,CDC）推薦的血清葡萄糖（GLU）測(cè)定參考方法（己糖激酶法）[1-2]，并結(jié)合中華人民共和國行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（WS/T 350-2011）[3]，參照GUM 1995、GUM 2003、JJF 1059和CNAS-GL05等標(biāo)準(zhǔn)對(duì)測(cè)量結(jié)果的不確定度進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量的，如血清葡萄糖[1-2]、血清總膽紅素[4]和血清尿素[5]等參考方法測(cè)量結(jié)果的不確定度評(píng)價(jià)提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣本 新鮮血清。

1.2 試劑與儀器 葡萄糖SRM 917c（美國國家標(biāo)準(zhǔn)局，NBS），其余試劑均購自Sigma公司。按照參考方法配制，實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。UV-2450紫外可見分光光度計(jì)（帶半導(dǎo)體溫控和磁力攪拌）（Shimadzu,Japan）和比色皿[QS，特定光徑（10±0.01）mm]用于吸光度（A）的測(cè)定；機(jī)械移液器（Eppendorf AG,Germany）用來吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液和試劑；SevenMulti型 pH計(jì)（Mettler Toledo, Switzerland）用來測(cè)定溶液pH值；1524型點(diǎn)溫計(jì)（Fluke USA）用于測(cè)定溶液和室內(nèi)溫度；XS205DU型分析天平（Mettler Toledo,Switzerland）用于稱取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和試劑；HH60型數(shù)顯恒溫?cái)嚢柩h(huán)水浴箱（常州國華，中國）用于控制試劑和樣本的溫度。

1.3 測(cè)定方法 測(cè)定原理：在己糖激酶催化下，葡萄糖和ATP發(fā)生磷酸化反應(yīng),生成葡萄糖-6-磷酸與ADP。葡萄糖-6-磷酸在葡萄糖-6-磷酸脫氫酶催化下脫氫,生成6-磷酸葡萄糖酸，同時(shí)使NAD（P）還原NAD（P）H。在NAD（P）轉(zhuǎn)化成NAD（P）H的同時(shí)，伴有340nm處摩爾消光系數(shù)的上升，摩爾消光系數(shù)變化與葡萄糖含量成正比,通過檢測(cè)339 nm處摩爾消光系數(shù)即可測(cè)定血清中葡萄糖含量。本次實(shí)驗(yàn)在1d內(nèi)完成，重復(fù)測(cè)定樣本和試劑空白各2次，將測(cè)定結(jié)果記錄后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 被測(cè)量的數(shù)學(xué)模型 血清葡萄糖的含量c（mmol/L）按下列公式計(jì)算：式中，A為樣本的吸光度；b0為校正曲線的截距；k為校正曲線的斜率；fc為標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度修正因子。

2.2 不確定度的來源分析 測(cè)量不確定度的主要來源有樣本的A值、校正曲線擬合、標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（包括標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量、定容、稀釋、再定容）和測(cè)量重復(fù)性。取樣體積、水浴時(shí)間等因素已在重復(fù)性中體現(xiàn)，故不單獨(dú)考慮這些因素。

2.3 分析和量化不確定度分量 標(biāo)準(zhǔn)和實(shí)際樣本測(cè)定：按參考方法進(jìn)行重復(fù)測(cè)定，測(cè)量數(shù)據(jù)見表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)和樣本的測(cè)量數(shù)據(jù)

2.3.1 重復(fù)性（rep） 由表1可知，實(shí)際樣本用參考方法進(jìn)行兩次測(cè)定，其標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.0055，那么重復(fù)性導(dǎo)致的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.2 A值校準(zhǔn)引起的不確定度 已知UV-2450紫外可見分光光度計(jì)的校準(zhǔn)證書給出的吸光度擴(kuò)展不確定度U=0.005，k=2，us（A）=0.005/2=0.0025。

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的不確定度 標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度可由下面公式計(jì)算得出：式中，m為稱取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量（g）；V500ml為母液的體積（500ml）；V100ml為稀釋液的體積（100ml）；Vx為移取母液的體積（x=0、5、10、20、30、40ml）

其不確定度來源包括標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量、定容、稀釋、再定容等幾個(gè)因素?，F(xiàn)逐個(gè)分析和量化各分量的不確定度，最后合成標(biāo)準(zhǔn)溶液的不確定度。

2.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)量 稱取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)約5.000g。采用減量法稱量，包括塑料稱量盤和毛重2次稱量。不確定度主要由天平校準(zhǔn)產(chǎn)生。天平校準(zhǔn)有3個(gè)不確定度來源：線性、重復(fù)性和偏載[6]。 u天平=標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)由兩次稱量得到，那么，其不確定度為：

2.3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液母液體積（V500ml） V500ml主要受到容量瓶校準(zhǔn)和溫度效應(yīng)的影響。

2.3.3.2.1 校準(zhǔn) 制造商（AS One）提供20℃、體積為（500±0.15）ml的容量瓶，按三角分布計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.3.3.2.2 溫度效應(yīng) 假設(shè)溫度變化范圍±4℃，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，近似矩陣分布，500ml水溶液產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

校準(zhǔn)和溫度效應(yīng)相互獨(dú)立，將這兩個(gè)分量合成，V500ml的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.3.3 移取母液體積（Vx） Vx主要受到移液管校準(zhǔn)和溫度效應(yīng)的影響。其引起不確定度的計(jì)算過程如表2所示。

表2 移液管的不確定度

移取母液體積為30和40ml時(shí)，其不確定度需要進(jìn)一步合成。通過計(jì)算可以得出移取30ml和40ml時(shí)，所引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為0.0235 ml和0.0281ml。

2.3.3.4 稀釋液體積（V100m）l標(biāo)準(zhǔn)溶液V100ml主要受到容量瓶校準(zhǔn)和溫度效應(yīng)的影響。

2.3.3.4.1 容量瓶校準(zhǔn) 制造商（AS One）提供20℃、體積為（100±0.08）ml的容量瓶按三角分布計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.3.4.2 溫度效應(yīng) 假設(shè)溫度變化范圍±4℃，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，近似矩陣分布，100ml水溶液產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

校準(zhǔn)和溫度效應(yīng)相互獨(dú)立，將這兩個(gè)分量合成，V100ml的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.3.5 合成標(biāo)準(zhǔn)溶液的不確定度 因各分量之間沒有相關(guān)性，故標(biāo)準(zhǔn)溶液的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度根據(jù)下面公式合成。

標(biāo)準(zhǔn)溶液修正因子的標(biāo)準(zhǔn)不確定度可以用下面公式表示：

由于（x=0，5，10，20，30，40ml）各點(diǎn)的計(jì)算結(jié)果非常相近，計(jì)算u（fc）時(shí)一般取中位數(shù)。但本文為了計(jì)算簡便，用代替?！?.00078

2.3.4 由回歸方程求得血清葡萄糖的濃度

2.3.4.1 回歸方程 根據(jù)表1中標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度對(duì)吸光度作圖所得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的校正曲線

設(shè)回歸方程為：A=b0+kc

用最小二乘法求回歸方程：b0=-n=0.06293，相關(guān)系數(shù)R2=0.9995，欲求c的不確定度，應(yīng)先求A、k、b0的不確定度，然后再合成。

2.3.4.2 回歸方程各項(xiàng)不確定度 將b0和k代入公式，求出Ai殘差νi=[Ai-（a+kci）]的實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)差sc/A:

斜率k

截距b0

k和b0的協(xié)方差：

k、b0、u（k）、u（b0）、Σvi2等結(jié)果均可在Origin軟件中求得。

已知，A=b0+kc，那么各影響量的靈敏系數(shù)分別為由校正曲線擬合導(dǎo)致的吸光度值的不確定度可以通過下面公式計(jì)算：

式中，c為樣本測(cè)量結(jié)果的均值。

2.3.4.3 吸光度A的標(biāo)準(zhǔn)不確定度 根據(jù)下面公式可計(jì)算出吸光度A的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

c的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.4 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度的計(jì)算 血清葡萄糖的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度如下合成：

2.5 血清葡萄糖含量測(cè)定結(jié)果的報(bào)告 擴(kuò)展不確定度U=k×uc，數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，具有95%置信度時(shí)，k=2，U= 0.29mmlo/L。血清葡萄糖含量測(cè)定結(jié)果為：（15.20±0.29）mmol/L，k=2。

3 討論

測(cè)量不確定度是衡量檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性和可靠性的重要參數(shù)，它在實(shí)驗(yàn)室中正確應(yīng)用可以衡量實(shí)驗(yàn)室科學(xué)管理和檢測(cè)水平。因而對(duì)其進(jìn)行合理的分析和評(píng)定是實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量體系的重要組成部分，也是醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理的重要內(nèi)容。我們通過測(cè)量血清葡萄糖的實(shí)驗(yàn)來探討醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室對(duì)參考方法測(cè)定血清葡萄糖的測(cè)量不確定度的評(píng)定方法，并試圖發(fā)現(xiàn)影響測(cè)定血清葡萄糖的主要影響因素。

使用電子表格計(jì)算方法[7]計(jì)算每個(gè)分量對(duì)測(cè)量結(jié)果的不確定度的相對(duì)貢獻(xiàn)。血清葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.14mmol/L。使用直方圖表示各分量的相對(duì)貢獻(xiàn)（圖2），可以得知，吸光度、標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和截距是影響血清葡萄糖測(cè)量不確定度的主要分量。因此，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和測(cè)定應(yīng)嚴(yán)加控制，確保測(cè)量結(jié)果具有較小的不確定度。

圖2 各分量的相對(duì)貢獻(xiàn)

在對(duì)血清葡萄糖測(cè)定結(jié)果進(jìn)行不確定評(píng)估時(shí)，我們引入標(biāo)準(zhǔn)溶液修正因子（fc）。由于20、30、40ml）各點(diǎn)的計(jì)算結(jié)果非常相近，所占的比重又不是很大，因此，本文為了計(jì)算簡便，在計(jì)算u（fc）時(shí)直接用代替（基于正常血清的參考值在標(biāo)準(zhǔn)曲線下方考慮）。

本文試圖將Origin 8.0作圖軟件應(yīng)用到測(cè)量不確定度計(jì)算過程中，標(biāo)準(zhǔn)曲線中的k、b0、u（k）、u（b0）、Σvi2等結(jié)果均可通過Origin 8.0軟件求得，這樣大大簡化了整個(gè)計(jì)算過程。

總之，參考方法測(cè)定血清葡萄糖的測(cè)量不確定度主要來源于標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率、截距和吸光度，因此，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和測(cè)定應(yīng)嚴(yán)加控制，確保測(cè)量結(jié)果具有較小的不確定度。臨床實(shí)驗(yàn)室的測(cè)量不確定度與傳統(tǒng)的測(cè)量誤差相比，更能反映測(cè)量的水平。對(duì)臨床檢驗(yàn)工作有一定的指導(dǎo)意義。本文中所描述的評(píng)估模式可以為采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量的，如血清葡萄糖、血清總膽紅素和血清尿素等參考方法測(cè)量結(jié)果的不確定度評(píng)價(jià)提供一定的科學(xué)依據(jù)。

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[7]Eurochem/CITACguide.Quantifying uncertaintyin analyticalmeasurement.2nd ed,EUROCHEM,2000.

（本文編輯：沈叔洪）

更正

本刊2012年第34卷第24期第2010頁作者單位更正為“315400余姚市人民醫(yī)院泌尿腎病外科”。

本刊編輯部

Application of reference method in evaluation of measurement uncertainty of serum glucose

XIE Fuyi,SUN Qi,WU Qiaoping.Depart-

ment of Laboratory Medicine, Lihuili Hospital,Ningbo 315041,China

Reference method Serum glucose Measurement uncertainty Standard and expanded uncertainties

2012-08-01）

315041 寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院檢驗(yàn)科