鐘少平 沈華祥 劉霞 周曉宇 葛加美 彭華

●論 著

可溶性Netrin-1受體對人滋養(yǎng)細(xì)胞株TEV-1增殖凋亡的影響

鐘少平 沈華祥 劉霞 周曉宇 葛加美 彭華

目的 觀察可溶性Netrin-1受體對人滋養(yǎng)細(xì)胞增殖凋亡的影響，探究Netrin-1/Neogenin通路在滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡過程中的機(jī)制。 方法 行早孕期滋養(yǎng)細(xì)胞株TEV-1培養(yǎng)，細(xì)胞預(yù)處理24h后，改用含不同濃度Neogenin的培養(yǎng)液，以濃度為0ng/ml的培養(yǎng)液為對照組，其余不同濃度Neogenin（1、5、10、50ng/ml）干預(yù)的培養(yǎng)液均為實(shí)驗(yàn)組。應(yīng)用噻唑藍(lán)（MTT）比色法、流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測細(xì)胞增殖指數(shù)、凋亡率；采用細(xì)胞免疫熒光法檢測Netrin-1蛋白在TEV-1細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，real-time PCR及Western印跡檢測Netrin-1 mRNA及Netrin-1蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果 不同濃度的Neogenin對TEV-1細(xì)胞增殖無明顯影響，但TEV-1細(xì)胞凋亡率隨Neogenin濃度的增加而增加。Netrin-1表達(dá)于滋養(yǎng)細(xì)胞胞質(zhì)。實(shí)驗(yàn)組當(dāng)Neogenin濃度達(dá)到50ng/ml時，TEV-1細(xì)胞表達(dá)Netrin-1 mRNA水平較對照組增加約40.38倍，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Netrin-1蛋白表達(dá)情況受Neogenin濃度影響不明顯（P＞0.05）。 結(jié)論 可溶性Netrin-1受體能促進(jìn)TEV-1細(xì)胞凋亡及Netrin-1 mRNA表達(dá)，Netrin-1/Neogenin通路參與了TEV-1細(xì)胞凋亡過程。

可溶性受體 滋養(yǎng)細(xì)胞 增殖 凋亡

可溶性受體廣泛存在于細(xì)胞外液中，作為相應(yīng)膜受體的競爭者與配體進(jìn)行結(jié)合，阻斷配體信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，影響細(xì)胞生物行為，在炎癥發(fā)生、腫瘤血管形成等過程中起到重要作用[1-2]。Neogenin作為一種特異與Netrin-1結(jié)合的膜受體，廣泛分布于機(jī)體神經(jīng)、肌肉及上皮組織。當(dāng)細(xì)胞外Netrin-1占據(jù)跨膜蛋白Neogenin胞外FC段的特異結(jié)合部位形成Netrin-1/Neogenin結(jié)合物后，通過Netrin-1/Neogenin通路進(jìn)行信號傳導(dǎo)，激活肌動蛋白，聚合呈纖絲狀，使細(xì)胞膜生出絲狀偽足樣并延伸，參與神經(jīng)、肌肉及腺體形成[3-4]。同時研究還發(fā)現(xiàn)，Neogenin可作為前凋亡因子誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]。楊昀等[6]研究表明 Netrin-1表達(dá)于滋養(yǎng)細(xì)胞，但 Netrin-1/ Neogenin通路是否介導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡過程仍有待研究。因此，我們通過可溶性Netrin-1受體，即人重組蛋白Neogenin胞外FC段，結(jié)合游離Netrin-1，檢測細(xì)胞增殖、凋亡的行為變化，探究Netrin-1/Neogenin通路在滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)行為中的功能。

1 材料和方法

1.1 材料 人早孕絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞株TEV-1由香港大學(xué)George S.W.Tsao博士惠贈，此細(xì)胞系來源早孕絨毛膜絨毛，具有絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞的免疫學(xué)和生物學(xué)表型[7]。人重組蛋白Neogenin胞外FC段（美國Alexis公司），DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基、新生牛血清、二甲基亞砜（DMSO）、噻唑藍(lán)（MTT）（美國Gibco公司），兔抗人Netrin-1單克隆抗體及SABC-FITC試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒（珠海健康元生物醫(yī)藥有限公司），Trizol試劑（美國Invitrogen公司），ReverTra Ace及SYBR Green real-time PCR master mix試劑盒（日本Toyobo公司），Lightcycler熒光480PCR擴(kuò)增儀（德國Roche公司），SDS-PAGE凝膠試劑盒（武漢谷歌生物科技有限公司）。Netrin-1特異性引物的核苷酸序列如下：正義鏈：5′-TGGGGCGGTTGTCCTATTTC-3′，反義鏈：5′-GCCTTGTTGCTTGGCGTGT-3′；β-actin特異性引物的核苷酸序列如下：5′-GTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3′，反義鏈：5′-CTGCTGTCACCTTCACCGTT-3′；以上序列均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 方法 將TEV-1細(xì)胞置于含15%新生牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2培養(yǎng)，待細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期時，用0.25%胰酶消化液解離。預(yù)處理細(xì)胞：按5×103個/孔接種于96孔板上，每孔體積200μl，培養(yǎng)24h至細(xì)胞完全貼壁。改用含不同濃度（0、1、5、10、50ng/ml）的Neogenin無血清培養(yǎng)液，其中不含Neogenin（即0ng/ml）的培養(yǎng)液為對照組，添加濃度1、5、10、50ng/ ml的Neogenin培養(yǎng)液組為實(shí)驗(yàn)組。

1.3 MTT比色法檢測 測定不同濃度Neogenin對TEV-1細(xì)胞增殖的影響。兩組培養(yǎng)液根據(jù)不同藥物濃度再分設(shè)3孔，并置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中24h，棄培養(yǎng)液，各孔加入20μl MTT，37℃孵育4h，棄上清液，再加入150μl DMSO溫和振蕩10min使結(jié)晶充分溶解、混勻，酶標(biāo)儀（波長490 nm）測定各孔吸光度。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測 測定Neogenin對TEV-1細(xì)胞凋亡的影響。預(yù)處理時改用6孔板，以1×106個/孔細(xì)胞接種得到不同濃度Neogenin干預(yù)24h后的TEV-1細(xì)胞，0.01M PBS緩沖液洗滌1次，0.25%胰酶消化液解離各孔細(xì)胞，1 500r/min離心5min，棄上清液收集細(xì)胞，0.01M PBS緩沖液重新懸浮細(xì)胞并計數(shù)。取含2×105個細(xì)胞的懸浮液，1 500r/min離心5min，棄上清液收集細(xì)胞，依次加入1×結(jié)合緩沖液（Binding Buffer）500μl、膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）5μl及碘化丙啶（PI）10μl，輕輕混勻。在室溫下避光反應(yīng)10min，30min后用流式細(xì)胞儀檢測，激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長530nm，通過捕捉到Annexin V、PI發(fā)出的熒光組成細(xì)胞直方圖，每個象限的點(diǎn)數(shù)及其占總點(diǎn)數(shù)的百分比即表示每種細(xì)胞的數(shù)目及所占細(xì)胞的百分比。在細(xì)胞直方圖內(nèi)的左上象限（Q1）、右上象限（Q2）、右下象限（Q3）及左下象限（Q4）分別代表損傷細(xì)胞、正常細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞及晚期凋亡細(xì)胞，其中總凋亡率為早期凋亡細(xì)胞及晚期凋亡細(xì)胞之和占所有細(xì)胞的百分比（Q2+Q4）。

1.5 細(xì)胞免疫熒光檢測 檢測TEV-1細(xì)胞表達(dá)情況。預(yù)處理時改用24孔板，以5×104個/孔細(xì)胞接種得到不同濃度Neogenin干預(yù)24h后的TEV-1細(xì)胞，棄培養(yǎng)基，0.01M PBS緩沖液洗滌2次，3min/次；4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min，0.01M PBS緩沖液洗滌4次，3min/次。加入0.1%聚乙二醇辛基苯基醚150μl作用20min，0.01M PBS緩沖液洗滌2次，3min/次。加入正常血清（1∶10）封閉20min后甩干，兔抗人Netrin-1單克隆抗體（1∶100）4℃過夜，0.01M PBS緩沖液洗滌2次，3min/次。各孔加入與兔抗人Netrin-1單克隆抗體相對應(yīng)的生物素化鼠抗兔IgG二抗（1∶100），置37℃恒溫箱30min后用0.01M PBS緩沖液洗滌3次，2min/次。滴加用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的鏈霉親和素復(fù)合體（1∶100），置37℃恒溫箱30min后甩干，再加入PI 5.0μg/ml。20min后用0.01M PBS緩沖液洗滌5次，4min/次。置于熒光顯微鏡下以藍(lán)光（波長488nm）激發(fā)后觀察。

1.6 real-time PCR檢測 檢測TEV-1細(xì)胞Netrin-1 mRNA表達(dá)情況。同F(xiàn)CM處理。采用Trizol-氯仿-異丙醇一步法提取細(xì)胞總RNA，按試劑盒說明將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA分子，應(yīng)用SYBR Green染料技術(shù)行實(shí)時定量PCR反應(yīng)。擴(kuò)增條件：首輪變性95℃×2min；變性95℃×15s、退火72℃×30s、延伸72℃×45s，末輪延伸72℃× 10min，40個循環(huán)。樣本擴(kuò)增和數(shù)據(jù)的獲得采用Roche熒光定量PCR儀，得到各濃度標(biāo)本的曲線，分析Ct值。TEV-1細(xì)胞Netrin-1 mRNA表達(dá)值（待測目的基因起始拷貝數(shù)/內(nèi)對照基因起始拷貝數(shù)）＝2-△△Ct；△△Ct＝△Ctβ-actin－△Ct待測樣品；△Ct＝Ct待測樣品－△Ct正常對照。

1.7 Western印跡檢測 同F(xiàn)CM處理。采用全蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)，行BCA法[8]測定蛋白濃度，各孔加入總蛋白質(zhì)20μg，經(jīng)12%聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯膜上，分別加入兔抗人Netrin-1單克隆抗體（1∶300）、鼠抗人β-actin單克隆抗體（1∶200），4℃孵育過夜。次日加入用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶3 000）或辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，結(jié)果曝光于醫(yī)用X線膠片上。將膠片進(jìn)行掃描，用凝膠圖像分析系統(tǒng)處理圖片條帶光密度值（代表Netrin-1蛋白表達(dá)情況）。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用 表示，均數(shù)間比較采用F檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度Neogenin對TEV-1細(xì)胞增殖的影響 經(jīng)不同濃度Neogenin培養(yǎng)24h后，實(shí)驗(yàn)組TEV-1細(xì)胞吸光度依次為0.28±0.06、0.26±0.05、0.29±0.01及0.31±0.03，與對照組的0.23±0.01比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），說明Neogenin的濃度對TEV-1細(xì)胞增殖無明顯影響。

2.2 不同濃度Neogenin對TEV-1細(xì)胞凋亡的影響 經(jīng)不同濃度Neogenin培養(yǎng)24h后，實(shí)驗(yàn)組TEV-1細(xì)胞總凋亡率依次為（37.30±1.84）%、（38.65±4.45）%、（39.25± 9.40）%及（56.65±9.83）%。可見，TEV-1細(xì)胞凋亡率隨Neogenin濃度的增加而增高，與對照組[（18.70±0.85）%]比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖1）。

圖1 不同濃度Neogenin干預(yù)24h后TEV-1細(xì)胞凋亡檢測圖（A：0ng/ml；B：1 ng/ml；C：5 ng/ml；D：10 ng/ml；E：50 ng/ml）

2.3 TEV-1細(xì)胞表達(dá)情況 細(xì)胞免疫熒光檢測表明，TEV-1細(xì)胞的細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃綠色熒光（圖2），細(xì)胞核被PI著色后呈現(xiàn)棕黃色熒光。未見其它明顯非特異性熒光反應(yīng)。

圖2 兔抗人Netrin-1蛋白單克隆抗體對TEV-1細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光檢測（A：×100倍；B：×200倍；C：×400倍）

2.4 TEV-1細(xì)胞Netrin-1 mRNA表達(dá)情況 real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)不同濃度Neogenin培養(yǎng)TEV-1細(xì)胞24h后，實(shí)驗(yàn)組TEV-1細(xì)胞表達(dá)Netrin-1 mRNA水平較對照組有明顯增加，其增加倍數(shù)依次為1.89±0.41、1.54±0.30、1.56±0.25、40.38±9.32。兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.5 TEV-1細(xì)胞Netrin-1蛋白表達(dá)情況 Western印跡檢測結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度Neogenin培養(yǎng)TEV-1細(xì)胞24h后，實(shí)驗(yàn)組Netrin-1蛋白表達(dá)量依次為0.86±0.02、0.83±0.01、0.84±0.03及0.92±0.04，與對照組0.79±0.01比較未見明顯增加，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

在探究神經(jīng)發(fā)育過程中的未知蛋白時，Vielmetter等學(xué)者于1994年通過提取孕18d的雞胚腦組織建立cDNA文庫并對其進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)一種新物質(zhì)——Neogenin，屬結(jié)腸、直腸癌缺失基因家族成員，細(xì)胞外含有4個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、6個FN3區(qū)域及與Netrin-1特異結(jié)合的部位[3，9]。Neogenin廣泛表達(dá)于脊椎動物胚胎神經(jīng)、上皮及肌肉組織中，參與細(xì)胞分化、遷移及增殖等過程。作為胚胎神經(jīng)前體細(xì)胞的特異性標(biāo)記物，Neogenin還參與細(xì)胞的分化過程[10]，并且與Netrin-1特異性結(jié)合后促進(jìn)神經(jīng)新生及軸突形成[11]。Neogenin極性表達(dá)于成腔上皮細(xì)胞膜上，與相鄰細(xì)胞特異性受體Netrin-1結(jié)合后通過Netrin-1/Neogenin通路誘導(dǎo)上皮細(xì)胞定向遷移、極性生長并互相黏附，從而形成完整的上皮結(jié)構(gòu)[12-13]。

Park等[14]學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，與其它VEGF、PDGF等有絲分裂原一樣，Netrin-1是一類具有較強(qiáng)促進(jìn)血管新生作用的蛋白。它通過刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其遷移并黏附于血管平滑肌細(xì)胞，參與新生血管網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。研究還發(fā)現(xiàn)，Netrin-1可促進(jìn)臍帶內(nèi)皮細(xì)胞增殖及管腔形成[15]。本研究改用不同濃度的Neogenin培養(yǎng)液干預(yù)24h后，具有絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞特性的TEV-1細(xì)胞Netrin-1 mRNA表達(dá)量有所升高；當(dāng)實(shí)驗(yàn)組Neogenin的濃度達(dá)到50ng/ml時，Netrin-1 mRNA水平較對照組增加40.38倍，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。另外，TEV-1細(xì)胞雖然能表達(dá)Netrin-1蛋白，但受Neogenin的濃度影響不明顯，具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

體內(nèi)存在的可溶性受體通常為膜受體的胞外段經(jīng)水解釋放的。目前，研究者常通過基因重組技術(shù)獲得具有可溶性受體特性的人重組蛋白，作為相應(yīng)膜受體的競爭者與配體進(jìn)行結(jié)合，阻斷配體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響細(xì)胞生物行為，在機(jī)體生命活動中起到重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，TEV-1細(xì)胞能表達(dá)Netrin-1蛋白起到維持細(xì)胞生長的作用。當(dāng)培養(yǎng)基中Netrin-1與游離蛋白Neogenin胞外Fc段結(jié)合后，培養(yǎng)基中游離Netrin-1的濃度下降，使得TEV-1細(xì)胞的Netrin-1/Neogenin通路信號傳導(dǎo)減弱，并通過反饋機(jī)制促進(jìn)Netrin-1轉(zhuǎn)錄及翻譯，最終導(dǎo)致Netrin-1 mRNA及Netrin-1蛋白水平升高。但由于Netrin-1蛋白表達(dá)升高不顯著，且被培養(yǎng)基中Neogenin部分中和，TEV-1細(xì)胞未受到足夠Netrin-1蛋白的刺激，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率增加。TEV-1細(xì)胞增殖情況無明顯改變可能與滋養(yǎng)細(xì)胞分泌其它細(xì)胞因子有關(guān)，具體機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，可溶性Netrin-1受體能促進(jìn)TEV-1細(xì)胞凋亡及Netrin-1 mRNA表達(dá)，Netrin-1/Neogenin通路參與了TEV-1細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)過程。

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Effect of soluble Netrin-1 receptor on proliferation and apoptosis of TEV-1 cells

ZHONG Shaoping,SHEN Huaxiang,LIU Xia,et al.

Department of Obstetrics，Jiaxing Women and Children Hospital,Jiaxing 314000,China

【 Abstract】 Objective To investigate the effect of soluble Netrin-1 receptor on proliferation and apoptosis of human trophoblast TEV-1 cells. Methods Cultured TEV-1 cells were treated with different concentrations of Neogenin (0,1,5,10 and 50ng/ml).After 24h of treatment cell viability was measured by MTT assay;cell apoptosis were assessed by flow cytometry(FCM) assay;the expression of Netrin-1 in TEV-1 cells was observed by indirect cellular immunofluorescence;the mRNA and protein of Netrin-1 were detected by real-time PCR and Western blot,respectively. Results The results of MTT and FCM showed that proliferation of TEV-1 cells was independent of Neogenin.Meanwhile,cell apoptosis increased with the increasing concentrations of Neogenin;the apoptosis rate was 18.70%at 0 ng/ml Neogenin and significantly increased to 56.65%at 50ng/ml Neogenin(P＜0.01).Immunoreactivity of Netrin-1 in cytoplasm of TEV-1 cells was increased along with the increasing concentration of Neogenin.Real-time PCR showed the level of Netrin-1 mRNA,increased by 40.38 times compared to control group when TEV-1 cell was exposed to 50ng/ml Neogenin（P＜0.05）;and the same tendency was not seen by using Western blot（P＞0.05）. Conclusion The soluble Netrin-1 receptor Neogenin enhances Netrin-1 mRNA expression and promotes cell apoptosis in TEV-1 cells,which indicates that Netrin-1/Neogenin pathway may play a role during regulating cell apoptosis of trophoblasts.

Soluble receptor TrophoblastProliferation Apoptosis

2012-03-14）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

嘉興市科技局基金資助項(xiàng)目（2011AY1052-2）；嘉興市政府重點(diǎn)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)基金資助項(xiàng)目（2011）

314000 嘉興市婦幼保健院產(chǎn)科

鐘少平，E-mail：zhong_hua86@yahoo.com.cn