張浩 郭治宇 胡桂英 周紹斌 許多嘉 施紅旗 樊靜 何忠平 金志剛吳波 洪毅 程俊峰 陸磊

下肢深靜脈血栓形成合并肺栓塞小型豬模型的建立及評價(jià)方法

張浩 郭治宇 胡桂英 周紹斌 許多嘉 施紅旗 樊靜 何忠平 金志剛吳波 洪毅 程俊峰 陸磊

目的 初步探尋建立下肢深靜脈血栓形成（DVT）合并肺栓塞（PE）的小型豬模型的方法。 方法 15只小型豬隨機(jī)分為3組（A、B、C）。每組通過結(jié)扎雙側(cè)股靜脈并注入氨甲苯酸以獲得DVT模型，并經(jīng)B超證實(shí)；3組實(shí)驗(yàn)豬分別于建模后第1、4、7天拆除雙側(cè)結(jié)扎線，并洗脫一側(cè)股靜脈內(nèi)自體血栓后行CT血管造影（CTA）檢查，若無肺栓塞影像學(xué)證據(jù)，則經(jīng)頭靜脈注入體外制備的血栓后再次行CTA檢查，7d后將小型豬處死并行病理學(xué)檢查。 結(jié)果 2只小型豬因嚴(yán)重肺炎排除，其余13只中11只DVT合并PE建模成功并經(jīng)病理證實(shí)，建模即刻成功率73．33%（7d后成功率53．33%），其中B組建模成功率為100%。其中11只DVT在B超上表現(xiàn)為股靜脈腔內(nèi)的條索狀低回聲；PE在CTA上表現(xiàn)為肺動(dòng)脈主干或分支的充盈缺損及截?cái)唷２±頇z查示肺動(dòng)脈內(nèi)見混有明膠海綿和自體血栓的栓塞物。結(jié)論 下肢DVT合并PE小型豬模型可成功建立；B超和CTA檢查可以較好的評價(jià)DVT和PE。

深靜脈血栓形成 肺栓塞 CT血管造影 B超 小型豬

【 Abstract】Objective To establish a piglet model of deep venous thrombosis (DVT)and pulmonary embolism(PE)．Methods The deep venous thrombosis was induced in 15 piglets by ligation of bilateral femoral vein and injection of aminomethylbenzoic acid,the DVT was confirmed by ultrasonography．DVT model piglets were randomly divided into 3 groups (n=5 in each),the ligation of femoral vein was released after 1d(group A),4d(group B)and 7d(group C),respectively．Then autologous blood clots of one side of the femoral vein were flushed and the lungs were examined with CT angiography(CTA)scan．If there was no evidence of pulmonary embolism,in vitro prepared autologous blood clots and gelatin sponge were injected through the cephalic vein to induce the PE;and the established DVT and PE were confirmed by CTA．The piglets were sacrificed after 7d,and the pathological examinations were performed．Results The DVT and PE were successfully induced in 11 piglets with the success rate of 73．3%(53．3%after 7d),while the success rate in group B was 100．0%．The DVT was presented on ultrasonography as endovenous strip-like hypoechoic foci．The presentation of PE on the CTA was filling-defect and truncation of the pulmonary trunk or branch．Pathological examination revealed pulmonary emboli mixed with gelatin sponge and autologous blood clots．Conclusion The piglet model of DVT and PE has been successfully established,which can be confirmed by ultrasonography and CTA．

【 Key words】Deep venous thrombosis Pulmonary embolism Computed tomographic angiography B-mode ultrasound Piglet

肺栓塞（pulmonary embolism，PE）是指內(nèi)源性或外 源性栓子阻塞肺動(dòng)脈及其分支引起急性肺循環(huán)功能障礙而導(dǎo)致的一系列臨床綜合征。下肢深靜脈血栓（deep venous thrombosis，DVT）形成是目前公認(rèn)的肺栓塞最常見原因，國外報(bào)道90%左右肺栓塞的栓子來自于下肢深靜脈[1]。DVT合并PE若不經(jīng)治療，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[2]臨床病死率達(dá)30%以上。而及早診斷及治療，可將病死率降至10%[3]。近年來關(guān)于DVT或PE的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型研究有了較大發(fā)展，但DVT-PE的動(dòng)物模型研究較少，建立DVT合并PE的動(dòng)物模型對研究其病理生理過程有重要意義，本研究嘗試建立DVT合并PE的小型豬模型，進(jìn)一步了解DVT合并PE的病理生理過程。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)用小型豬為普通級廣西巴馬小型豬，由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供[動(dòng)物許可證號：SCXK（滬）2010-0025]，月齡5～6個(gè)月，體重（20±2.5）kg，共15只，其中雌性8只，雄性7只，健康無肺炎。飼養(yǎng)于金華市食品藥品監(jiān)督所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基地，飼料為502專用仔豬料（鄭州利源飼料有限公司）。

1.1.2 主要設(shè)備及儀器 CT機(jī)（德國西門子16排螺旋CT）；彩色多普勒超聲(荷蘭 Philips iu22)；氨甲苯酸（常州康普藥業(yè)有限公司10ml/支）；氯胺酮（福建古田藥業(yè)有限公司，2ml/支）；丙泊酚（西安力邦制藥有限公司，50ml/瓶）；戊乙奎醚（成都力思特制藥股份有限公司，1ml/支）。

1.2 方法

1.2.1 分組 將15只小型豬隨機(jī)分為A、B、C 3組，每組5只。

1.2.2 動(dòng)物麻醉與監(jiān)測 麻醉前測動(dòng)物體重，以戊乙奎醚0.02mg/kg+氯胺酮8mg/kg于頸后部肌內(nèi)注射進(jìn)行基礎(chǔ)麻醉，約5～10min小型豬自行臥倒，將其仰臥固定在實(shí)驗(yàn)手術(shù)臺(tái)上，給予面罩吸氧（氧流量5L/min）。然后于一側(cè)耳緣靜脈套管針穿刺輸液，輸注乳酸林格液8～10ml/（kg·h）補(bǔ)充基礎(chǔ)和禁食所需。其中8只采用丙泊酚5mg/（kg·h）+氯胺酮5 mg/（kg·h）麻醉維持，其余7只采用氯胺酮8～10 mg/（kg·h），實(shí)驗(yàn)過程中如果實(shí)驗(yàn)豬有明顯體動(dòng)可追加氯胺酮1mg/kg。實(shí)驗(yàn)中全程用便攜式氧飽和度儀監(jiān)測豬耳部氧飽和度和心率，肉眼觀察呼吸（腹部起伏頻率）。

1.2.3 模型建立 通過結(jié)扎雙側(cè)股靜脈約2～3cm，并注入止血藥物氨甲苯酸注射液0.1ml制作DVT模型。同時(shí)穿刺股動(dòng)脈抽取動(dòng)脈血19ml+氨甲苯酸注射液1ml，靜置冰箱，保持溫度3～4℃，體外制備混合性血栓。A組術(shù)后24h打開雙側(cè)腹股溝切口，探查股靜脈有無血栓形成。洗脫一側(cè)股靜脈血栓后行CTA檢查，了解有無肺動(dòng)脈栓塞。若無肺動(dòng)脈栓塞則經(jīng)一側(cè)前肢頭靜脈切開插管，將明膠海綿2塊（2.0cm×1.0cm×0.5cm）及體外制備的混合性血栓注射入上腔靜脈，使之隨血流經(jīng)過心臟后泵入肺動(dòng)脈導(dǎo)致肺動(dòng)脈栓塞。再次行CTA檢查有無肺栓塞。B組于股靜脈結(jié)扎術(shù)后4d，C組于股靜脈結(jié)扎術(shù)后7d行相同操作。

1.2.4 B超檢查 術(shù)前檢查雙側(cè)股靜脈血栓形成情況及拆除結(jié)扎線后股靜脈血栓的情況。

1.2.5 CT血管造影（computed tomographic arteriography，CTA）檢查 豬麻醉成功后平放CT機(jī)，經(jīng)靜脈套管連接高壓注射器。通過耳朵放置經(jīng)皮血氧飽和度監(jiān)測儀，實(shí)時(shí)記錄心率和血氧飽和度情況。先行胸部CT平掃檢查，了解肺部有無炎癥等情況。洗脫一側(cè)血栓，采用37g/100ml碘海醇注射液行CTA檢查，注射劑量1.5mg/ kg，注射速度4ml/min，攝片延遲18s采集動(dòng)脈增強(qiáng)期肺動(dòng)脈影像。10min后經(jīng)預(yù)置的前肢頭靜脈硅膠管注入明膠海綿2塊及體外制備的混合性血栓20ml，同時(shí)觀察血氧飽和度和心率變化情況，若出現(xiàn)血氧飽和度＜90%和心率增快10%～20%左右變化，提示PE成功可能，立即再次行CTA檢查確認(rèn)是否成功。

1.2.6 大體解剖 PE模型制備成功后7d處死小型豬，迅速解剖，完整分離心肺。沿上腔靜脈-右心房-右心室-肺動(dòng)脈主干-肺動(dòng)脈左右分支-肺葉動(dòng)脈-肺段動(dòng)脈-各分支小動(dòng)脈順序依次切開，肉眼觀察動(dòng)脈內(nèi)有無血栓。

1.2.7 病理學(xué)檢查 病變肺組織標(biāo)本用4%甲醛液固定后送我院病理室行病理學(xué)檢查，采用HE染色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用StataSE 11.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)及Fisher精確檢驗(yàn)。計(jì)量資料首先進(jìn)行峰度及偏度檢驗(yàn)，對于正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，其組間值比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布資料采用秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)過程中，2只小型豬因嚴(yán)重肺部感染中途退出實(shí)驗(yàn)（A、C組各1只），其余13只小型豬全部按計(jì)劃完成實(shí)驗(yàn)。

2.1 DVT模型

2.1.1 DVT建模成功率 完成實(shí)驗(yàn)的13只小型豬DVT模型均建模成功（即刻成功率86.7%）。其中A組保留時(shí)間短，7d后復(fù)查B超股靜脈血栓均消失，而B、C組血栓在7d后復(fù)查均存在（7d后建模成功率60.0%）。

2.1.2 DVT的大體解剖 A組于1d后拆除縫線，局部無明顯粘連，含有血栓的血管解剖清晰，易于分離，洗脫容易，手術(shù)時(shí)間短，手術(shù)時(shí)間為（143.75±4.79）min。7d后復(fù)查B超DVT消失，解剖亦未發(fā)現(xiàn)DVT，提示1d形成的血栓較易溶解（0/4）。B組于4d后拆除縫線，局部少許粘連，含有血栓的血管解剖清晰，較易分離，洗脫較容易，手術(shù)時(shí)間短，手術(shù)時(shí)間為（139.00±11.94）min。7d后復(fù)查B超及解剖均可見DVT(5/5)。C組于7d后拆除縫線，局部粘連致密，含有血栓的血管解剖及分離困難，洗脫困難，手術(shù)時(shí)間長，手術(shù)時(shí)間為（163.75±4.79）min。7d后復(fù)查B超及解剖仍可見DVT(4/4)。A組與B、C組比較，7d后DVT存留均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05）。A、B組與C組比較，手術(shù)時(shí)間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05）。提示4、7d后形成的血栓較穩(wěn)定。而B組形成的血栓穩(wěn)定且解剖相對容易，更適合DVT建模。見圖1。

圖1 DVT大體解剖[A：股靜脈血栓（箭頭所示）；B：血栓停留在右心房（箭頭所示）]

2.1.3 B超對DVT的評價(jià) DVT在B超上表現(xiàn)為股靜脈腔內(nèi)的條索狀低回聲，見圖2。本次實(shí)驗(yàn)13只小型豬在術(shù)前經(jīng)B超判斷有無DVT，然后經(jīng)過解剖證實(shí)，兩者符合率為100.0%（13/13，9/9，4/4）。提示B超對小型豬DVT有較好的評估價(jià)值，見表1。

圖2 DVT的B超表現(xiàn)

表1 B超及解剖診斷DVT的對照（只）

2.2 DVT-PE模型

2.2.1 DVT-PE建模成功率 13只小型豬應(yīng)用自體血栓洗脫方法均未能在CTA上發(fā)現(xiàn)PE，而加用注射體外混合性血栓的方法，其中11只術(shù)后即刻和術(shù)后7d均可在CTA上發(fā)現(xiàn)典型的PE影像學(xué)表現(xiàn)（即刻和7d后建模成功率均為73.3%）。A組中1只小型豬未在CTA上發(fā)現(xiàn)PE，而大體檢查發(fā)現(xiàn)有PE，而C組1只小型豬血栓停留在右心房中，見圖1B。洗脫血栓與洗脫血栓+體外注射混合性血栓兩種方法比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），見表2。結(jié)合DVT的成功率，DVT-PE總建模成功率為53.3%。其中A組的DVT-PE建模成功率為0.0%，C組為60.0%，而B組的則高達(dá)100.0%。

表2 洗脫單側(cè)肢體血栓與體外注射血栓合劑對照（只）

2.2.2 小型豬生命體征變化 洗脫自體血栓后，小型豬生命體征（心率及血氧飽和度）均無明顯變化。而在注射體外制備混合性血栓后即刻，小型豬出現(xiàn)心率增快，血氧飽和度下降，持續(xù)約30～60min后可基本緩解。注射前10min心率為（141.46±5.61）次/min，血氧飽和度為（92.23±1.24）%，而注射后心率為（171.54±16.82）次/min，血氧飽和度為（80.31±4.23）%，兩者比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。

2.2.3 CTA對PE的評價(jià) PE在CTA上表現(xiàn)為肺動(dòng)脈主干或分支的充盈缺損或截?cái)?，見圖3。13只小型豬中，11只術(shù)后7d在大體解剖和病理學(xué)檢查上均能發(fā)現(xiàn)PE，1只未在CTA發(fā)現(xiàn)，但大體檢查可發(fā)現(xiàn)有PE。另外1只血栓停留在右心房中，未進(jìn)入肺動(dòng)脈。CTA評價(jià)小型豬PE模型的敏感性為91.7%，特異性為100.0%，與病理學(xué)檢查所見對照見表3。

2.2.4 病理學(xué)檢查 病理學(xué)大體及鏡下檢查示肺動(dòng)脈內(nèi)見混有明膠海綿和自體血栓的栓塞物，同時(shí)還可發(fā)現(xiàn)肺的炎癥反應(yīng)，見圖4-5。

3 討論

PE臨床并不少見，如不治療病死率較高，而其最常見原因?yàn)橄轮獶VT，因此建立一種DVT合并PE的動(dòng)物模型對其病理生理過程研究有重要意義，本研究成功建立了小型豬下肢DVT合并PE的動(dòng)物模型，為今后進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇 文獻(xiàn)報(bào)道目前建立PE的動(dòng)物模型常選擇兔、鼠、犬、豬等[4]，相比于前3者，本研究選擇以小型豬為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，鑒于小型豬各器官系統(tǒng)在種屬進(jìn)化方面與人類更為接近，易于飼養(yǎng)，習(xí)性較為溫順，不具有攻擊性，且體積適宜，實(shí)驗(yàn)操作相對簡單。同時(shí)小型豬肺葉結(jié)構(gòu)發(fā)育較好，肺組織厚度適宜[5]且肺組織受支氣管動(dòng)脈及肺動(dòng)脈雙重血供，代償能力較強(qiáng)，不易因建立PE模型而發(fā)生猝死。麻醉相對簡單，容易控制；模型建成后易經(jīng)CT或B超客觀評價(jià)；且經(jīng)前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小型豬下肢血管容易暴露，易于操作，自身抗感染能力較好；但小型豬模型制作成本相對昂貴。

圖3 CTA對PE的評價(jià)[A：正常肺CTA；B：PE CTA（箭頭所指）；C：正常肺CTA冠狀面；D：PE CTA冠狀面（箭頭所指）]

表3 CTA和病理學(xué)檢查對PE的評價(jià)（只）

圖4 PE的大體檢查[A：左肺動(dòng)脈開口處血栓（箭頭所指）；B：血栓呈分叉騎跨狀（箭頭所指）]

圖5 PE的鏡下檢查[A：肺血管血栓（箭頭所指）；B：血栓及明膠海綿混合物（箭頭所指），HE染色，×100]

3.2 血栓制備及建模方法 預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)單純通過體內(nèi)自體血栓洗脫的方式獲得的栓子量較少，在CTA上未能發(fā)現(xiàn)典型的PE表現(xiàn)。故本研究加用體外注射栓子的方式，即先取小型豬自體血加入氨甲苯酸制成自體血凝塊并混有明膠海綿以形成體外混合性血栓，而所用明膠海綿微粒直徑3.8～4.2mm，近似于人類亞段肺動(dòng)脈直徑，能隨意裁剪形狀，且無抗原性，栓塞血管后易促使血栓形成，獲得相對穩(wěn)定的動(dòng)物模型[6-7]；利用硅膠管經(jīng)小豬頭靜脈插入15cm（約至右心房），通過體外注入混合性血栓20ml，經(jīng)CTA證實(shí)成功建成DVT-PE模型。

文獻(xiàn)報(bào)道DVT建模后的第1、4、7天分別有紅色、混合、機(jī)化血栓形成[8-9]，而紅色血栓軟易脫落，且易被動(dòng)物體內(nèi)的纖溶系統(tǒng)溶解；機(jī)化血栓因與血管壁粘連致密，不易脫落形成栓塞，這與本研究過程中發(fā)現(xiàn)DVT建模后第4天血栓形成較為牢固并且解剖相對容易一致。

選擇小型豬淺靜脈（頭靜脈）切開插管，相比經(jīng)頸內(nèi)靜脈切開或下腔靜脈置管注入血栓有以下優(yōu)點(diǎn)：頭靜脈體表位置表淺，只需切長約0.5～1.0cm小切口即可；且粗細(xì)適宜，可植入外徑約4.0mm，內(nèi)徑約3.0mm的橡膠管，滿足對血栓輸注的要求；至右心房距離短，只需插管約15cm即可達(dá)到右心房，減少了血栓在血液循環(huán)過程中的損耗；操作過程創(chuàng)傷小，術(shù)后恢復(fù)快。

3.3 模型評價(jià)方法 DVT模型可通過血管B超檢查發(fā)現(xiàn)股靜脈腔內(nèi)索條狀低回聲得以確認(rèn)，而本研究主要評價(jià)增強(qiáng)螺旋CT對PE診斷的敏感性；目前已有實(shí)驗(yàn)[10-12]以病理檢查為金標(biāo)準(zhǔn)，探討核素肺灌注顯像、增強(qiáng)螺旋CT及數(shù)字減影肺動(dòng)脈造影對豬急性PE實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停ㄏ喈?dāng)于人類亞肺段水平PE）的影像學(xué)特點(diǎn)，結(jié)果顯示核素肺灌注顯像對豬肺段（相當(dāng)于人類亞肺段）PE的探測優(yōu)于增強(qiáng)螺旋CT，是目前首選的檢查手段；而后者對栓子定位優(yōu)于前者；數(shù)字減影肺動(dòng)脈造影對豬肺段PE診斷能力最強(qiáng)，但有創(chuàng)故應(yīng)用受限。本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)曾仔細(xì)解剖過小型豬的肺標(biāo)本，對豬肺血管走形相對熟悉，且明膠海綿堵塞豬肺動(dòng)脈能形成的自遠(yuǎn)而近亞段以上的栓子。實(shí)驗(yàn)中15只小型豬中11只，在CTA上能較明顯發(fā)現(xiàn)肺動(dòng)脈內(nèi)完全或不完全的充盈缺損，特異性100%，故筆者認(rèn)為CTA對豬PE模型的評價(jià)敏感性相對較高；如小型豬在CT檢查過程中改用球囊輔助通氣以消除自主呼吸所致的偽影，并結(jié)合多排螺旋CT，縮短掃描時(shí)間，能最大程度降低假陽性或假陰性率。

綜上所述，此方法建立的DVT-PE模型穩(wěn)定可靠，能模擬PE的病理生理過程，可用于各類藥物實(shí)驗(yàn)和外科實(shí)踐，比如可用于評估溶栓藥物對肺動(dòng)脈血栓和下肢深靜脈血栓的溶解效能，也可用于肺動(dòng)脈和下肢靜脈取栓術(shù)、肺動(dòng)脈血栓抽吸術(shù)等，值得推廣和進(jìn)一步研究。

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Establishment of deep venous thrombosis and pulmonary embolism model in piglet

2012-11-14）

（本文編輯：胥昀）

浙江省科技廳浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技計(jì)劃項(xiàng)目（2009F80002）

321000 浙江大學(xué)金華醫(yī)院（金華市中心醫(yī)院）血管外科（張浩、郭治宇、金志剛、吳波、洪毅、程俊峰、陸磊），麻醉科（胡桂英、許多嘉），影像科（周紹斌），超聲科（樊靜），病理科（施紅旗）；金華市食品藥品監(jiān)督所（何忠平）

郭治宇，E-mail：zhiyuguo@sohu.com