王煒　劉斌　童春義　程小廣　陳稚　趙毅　胡新榮

[摘要] 目的 探討鹽酸米托蒽醌誘導(dǎo)人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2凋亡作用和機(jī)制。 方法 用CCK-8細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒檢測鹽酸米托蒽醌對CNE-2細(xì)胞生長的抑制作用，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)藥物積聚量與細(xì)胞凋亡率之間的關(guān)系，共聚焦檢測鹽酸米托蒽醌在細(xì)胞中的定位。 結(jié)果 鹽酸米托蒽醌對CNE-2細(xì)胞生長具有抑制作用，呈時(shí)間和劑量依賴性，并能有效誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其在細(xì)胞中主要以斑點(diǎn)形式分布在細(xì)胞質(zhì)中。 結(jié)論 鹽酸米托蒽醌能抑制人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2細(xì)胞生長，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，CNE-2細(xì)胞的藥物敏感性與藥物在細(xì)胞內(nèi)的分布位置有直接關(guān)系。

[關(guān)鍵詞] 鹽酸米托蒽醌；鼻咽癌；生長抑制；凋亡

[中圖分類號] R739 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號] 1674-0742（2013）01（b）-0015-02

鼻咽癌是亞洲常見的頭頸部惡性腫瘤之一，目前臨床上治療手段以放療為主，5年總生存率為59%～75%[1-2]。多項(xiàng)研究均證實(shí)，對復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的鼻咽癌，同步放、化療可使總生存率提高8%～30%[3-4]，但此方法的最佳組合模式和新化療藥物的療效尚有待明確。鹽酸米托蒽醌是一種細(xì)胞周期非特異性的蒽環(huán)類抗腫瘤藥物，結(jié)構(gòu)與阿霉素相似，能抑制DNA和RNA合成，心臟毒性小，主要用于惡性淋巴瘤、乳腺癌和急性白血病，對肺癌、黑色素瘤、卵巢癌和頭頸部癌也有一定療效[5]。目前有關(guān)鹽酸米托蒽醌對鼻咽癌作用效果及其機(jī)制研究少見報(bào)道，該實(shí)驗(yàn)擬通過觀察鹽酸米托蒽醌在體外條件下對人低分化鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2細(xì)胞生長增殖及凋亡的影響，并對機(jī)制進(jìn)行初步探討，以證實(shí)其在鼻咽癌治療中的可能應(yīng)用前景。

1 資料與方法

1.1 一般資料

人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室自建，鹽酸米托蒽醌購于江蘇南通精華制藥有限公司， DEME培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，CCK-8細(xì)胞中增殖和細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自江蘇碧云天生物科技研究所，PI（碘化丙啶）購于Sigma公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與藥物處理

取對數(shù)生長期的CNE-2細(xì)胞以106 mL濃度接種于含10% 胎牛血清、100 IU/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素的DEME培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)瓶壁貼滿細(xì)胞時(shí)，加入鹽酸米托蒽醌注射液，使樣品的藥物濃度分別為0.1、0.5、1、1.5、 2 μg/mL 。

1.3 CCK-8細(xì)胞中增殖和細(xì)胞毒性檢測試劑盒檢測

對數(shù)生長期的CNE-2細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，接種于96孔板內(nèi)，每孔2×103個(gè)細(xì)胞，體積為100μL/孔，設(shè)陰性對照組和空白對照組。其余細(xì)胞三孔為1組，培養(yǎng)24 h后每孔加入不同濃度的鹽酸米托蒽醌繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h后，每孔加CCK-8試劑10 μL， 繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，在酶標(biāo)儀上檢測樣品450 nm處吸光度OD值，計(jì)算細(xì)胞增殖率，細(xì)胞增殖率=（藥物處理孔的 OD 值-空白對照孔的 OD 值）/（陰性對照孔的 OD 值-空白對照孔的 OD 值） ×100%。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞內(nèi)藥物濃度

取對數(shù)生長期CNE-2細(xì)胞，不同濃度鹽酸米托蒽醌培養(yǎng)2 h后，棄上清，PBS洗1次，0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化后，PBS洗2次后，加入1 mL 4 ℃預(yù)冷PBS懸浮細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)鹽酸米托蒽醌的熒光強(qiáng)度。（鹽酸米托蒽醌激發(fā)光譜630～650 nm，發(fā)射光譜685 nm）。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

藥物處理24 h后的細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化收集，PBS洗滌細(xì)胞2次，2 000 rpm離心5 min收集5×105細(xì)胞，加入500 L的Binding Buffer懸浮細(xì)胞后，加入5 L Annexin V-FITC混勻，再加入5L PI混勻，室溫避光反應(yīng)15 min后上流式細(xì)胞儀的檢測。

1.6 共聚焦檢測細(xì)胞內(nèi)藥物定位情況

對數(shù)生長期CNE-2細(xì)胞接種于共聚焦培養(yǎng)小皿內(nèi)24 h后，加入1 μg/mL藥物處理1 h后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌兩次后，將細(xì)胞與共聚焦顯微鏡下檢測細(xì)胞內(nèi)鹽酸米托蒽醌的熒光強(qiáng)度和定位情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 鹽酸米托蒽醌對CNE-2細(xì)胞增殖的抑制作用

不同濃度的米托蒽醌分別作用于人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞24 h和48 h，CCK-8法檢測它的增殖抑制效果。結(jié)果表明（見表1）：當(dāng)時(shí)間不變時(shí)，隨著鹽酸米托蒽醌劑量的增大，對CNE-2細(xì)胞抑制作用增強(qiáng)，且呈劑量依賴性；在同一藥物濃度情況下，隨著藥物作用時(shí)間的延長，藥物對細(xì)胞株增殖的抑制作用也有所增強(qiáng)，呈時(shí)間依賴性。鹽酸米托蒽醌作用48 h后，1.5-2.0μg/mL各組的細(xì)胞增殖抑制率均超過80%。鹽酸米托蒽醌分別處理細(xì)胞24、48 h，其24 h和48 h半抑制濃度IC50值分別為1.89、0.098μg/mL。選擇24 h作為后續(xù)研究的作用時(shí)間。

3 討論

鹽酸米托蒽醌是一種抗腫瘤藥物，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道微克級濃度可抑制細(xì)胞增殖，亞毫克級濃度可使CHO、FL、SGC-7901等細(xì)胞株克隆形成能力下降[6]。在臨床上，其廣泛應(yīng)用于腫瘤的治療，但鮮見關(guān)于鹽酸米托蒽醌用于鼻咽癌治療和作用機(jī)制的報(bào)道。

該研究結(jié)果顯示，鹽酸米托蒽醌能抑制人鼻咽癌細(xì)胞的生長和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并呈時(shí)間和劑量依賴性。形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，低于1 μg/mL濃度鹽酸米托蒽醌作用的細(xì)胞6 h內(nèi)無明顯變化，藥物濃度大于1 μg/mL作用細(xì)胞6 h后，有細(xì)胞開始變形，細(xì)胞膜皺縮，呈現(xiàn)壞死的形態(tài)。流式結(jié)果顯示，藥物濃度0～1 μg/mL范圍內(nèi)，細(xì)胞對于藥物的內(nèi)吞藥物量與作用濃度成正比，當(dāng)藥物濃度大于1.5 μg/mL時(shí)候，細(xì)胞的內(nèi)吞藥物量并沒有明顯變化，說明由于細(xì)胞自身耐藥蛋白的外排作用，使高濃度藥物并不能有效的進(jìn)入細(xì)胞的內(nèi)部引起細(xì)胞程序性凋亡，而是通過藥物的毒性直接引起細(xì)胞壞死。

共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示，鹽酸米托蒽醌的紅色的熒光明亮，主要以斑點(diǎn)狀分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，少量分布于細(xì)胞核。米托蒽醌藥物的細(xì)胞內(nèi)定位與細(xì)胞的藥物敏感性有著密切的關(guān)聯(lián)，有研究顯示[7]在兩種對米托蒽醌敏感程度不同的乳腺癌細(xì)胞系中，較為敏感的細(xì)胞中的藥物熒光更亮且呈斑點(diǎn)狀分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。復(fù)合納米粒的藥物通過增加乳腺癌細(xì)胞對鹽酸米托蒽醌的攝取量，使細(xì)胞內(nèi)藥物濃度增加而增強(qiáng)細(xì)胞的藥物敏感性[8]。

對于臨床的鼻咽癌治療，新的敏感化療藥物的選用一直是研究的熱點(diǎn)。鹽酸米托蒽醌屬于用于其他腫瘤化療的成熟藥物，如能有效的治療鼻咽癌，將能省去漫長的臨床試驗(yàn)過程，且研究顯示藥物的細(xì)胞內(nèi)濃度和定位與細(xì)胞的藥物敏感性有直接的聯(lián)系，應(yīng)用此方法可以首先在體外對病人是否對藥物敏感進(jìn)行評價(jià)，繼而進(jìn)行有效化療免去不必要的痛苦。該研究結(jié)果顯示在低濃度藥物處理1 h后，鹽酸米托蒽醌能快速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)聚集成斑點(diǎn)狀，且能有效的誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入程序性凋亡。該研究為鹽酸米托蒽醌運(yùn)用于鼻咽癌治療提供了體外的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但是由于體外和體內(nèi)環(huán)境的差異以及鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展過程的復(fù)雜性，該藥物對鼻咽癌的治療效果和作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

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（收稿日期：2012-08-20）