趙艷梅，閆玉仙，常留栓，陳 寧

多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，有些藥物麻醉及術(shù)后?？砂l(fā)生認(rèn)知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction，POCD)［1］，表現(xiàn)為認(rèn)知能力異常、記憶受損、焦慮、人格改變、精神錯(cuò)亂等，嚴(yán)重者可出現(xiàn)癡呆，其確切機(jī)制迄今不明。研究認(rèn)為，大腦神經(jīng)元數(shù)量、與認(rèn)知有關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸、乙酰膽堿等及相應(yīng)受體不足，引起神經(jīng)元突觸可塑性的改變可能是POCD 產(chǎn)生的原因之一［2］。海馬富含谷氨酸能神經(jīng)元，一直認(rèn)為是與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)的重要腦區(qū)。為了闡明海馬神經(jīng)元中谷氨酸受體與麻醉產(chǎn)生的認(rèn)知障礙之間的關(guān)系，本研究測(cè)定了芬太尼、咪達(dá)唑侖復(fù)合麻醉對(duì)大鼠認(rèn)知功能的影響，并檢測(cè)了與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的谷氨酸受體——N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體亞單位NR1 和NR2B 在大鼠海馬組織中的基因表達(dá)變化，探討NMDA 受體與認(rèn)知障礙形成的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

芬太尼(湖北宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)060208)、咪達(dá)唑侖(江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)20111219)、鹽酸納洛酮(美國(guó)Sigma 公司);氟馬西尼(海南靈康制藥有限公司，批號(hào):091103);BP-2 大鼠無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)(成都泰盟科技有限公司)、Y 型電迷宮(張家港市生物醫(yī)學(xué)儀器廠);DY-89 Ⅱ型電動(dòng)玻璃勻漿器(寧波新芝生物科技股份有限公司);RNA 提取試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司);TaKaRa RNA PCR Kit AMV3.0(大連寶生物工程有限公司);100bp DNA MarkerⅠ、GoldView 核酸染料(北京博邁德科技發(fā)展有限公司);瓊脂糖(Sigma)，引物合成由北京奧科生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

雄性Wistar 大鼠18 只，SPF 級(jí)，體重180～220g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK-(軍)2007-004。雄性Wistar 大鼠隨機(jī)分為3 組，分別為對(duì)照組、復(fù)合麻醉組、催醒組，每組6 只，復(fù)合麻醉組和催醒組均腹腔注射芬太尼0.5mg/kg、咪達(dá)唑侖50mg/kg 進(jìn)行麻醉誘導(dǎo)，催醒組大鼠在麻醉起效30min 后腹腔注射納絡(luò)酮0.5mg/kg、氟馬西尼0.8mg/kg 進(jìn)行動(dòng)物催醒。對(duì)照組腹腔注射等體積的生理鹽水。

1.3 麻醉誘導(dǎo)與復(fù)蘇

1.3.1 一般生理指標(biāo)測(cè)定 復(fù)合麻醉組及催醒組動(dòng)物在整個(gè)麻醉誘導(dǎo)與復(fù)蘇過(guò)程中，每隔5～10min監(jiān)測(cè)大鼠體溫、呼吸頻率、心率和血壓。其中心率和血壓的變化采用大鼠無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)觀察，溫度計(jì)記錄肛溫，通過(guò)觀察大鼠胸廓運(yùn)動(dòng)來(lái)記錄呼吸頻率。

1.3.2 麻醉起效及復(fù)蘇時(shí)間測(cè)定 麻醉誘導(dǎo)效應(yīng)以翻正反射消失為標(biāo)準(zhǔn)。以大鼠前爪不能自行翻轉(zhuǎn)為俯臥位，且維持時(shí)間≥10s 作為大鼠前爪翻正反射消失的標(biāo)準(zhǔn)。催醒組大鼠于誘導(dǎo)起效30min后注射拮抗劑納絡(luò)酮0.5mg/kg 和氟馬西尼0.8mg/kg 催醒動(dòng)物，記錄動(dòng)物復(fù)蘇時(shí)間。復(fù)合麻醉組記錄自然復(fù)蘇時(shí)間。

1.4 復(fù)合麻醉對(duì)大鼠認(rèn)知功能的影響(Y 迷宮實(shí)驗(yàn))

動(dòng)物麻醉復(fù)蘇后繼續(xù)飼養(yǎng)7d，1～7d 每日進(jìn)行Y 迷宮實(shí)驗(yàn)，觀察麻醉誘導(dǎo)及催醒對(duì)大鼠認(rèn)知功能的影響。具體方法如下:在安靜的暗室內(nèi)用Y 迷宮測(cè)定。Y 迷宮箱底為銅柵間隔，每臂末端有信號(hào)燈，燈亮?xí)r箱底的銅柵無(wú)電流，提示為安全區(qū)。每次測(cè)試均在同一時(shí)間段進(jìn)行，測(cè)試時(shí)調(diào)節(jié)刺激電壓以保證大鼠在10s 內(nèi)逃避跑動(dòng)，大鼠受電擊后直接跑到安全區(qū)為正確反應(yīng)，否則為錯(cuò)誤反應(yīng)。每次大鼠跑至安全區(qū)后持續(xù)光亮15s，繼而熄燈45s 后行下一次測(cè)試，燈光出現(xiàn)的方位按照隨機(jī)次序變換，每日連續(xù)測(cè)量10 次，觀察其正確反應(yīng)次數(shù)，以正確反應(yīng)率作為認(rèn)知功能的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.5 麻醉誘導(dǎo)與藥物催醒對(duì)NR1、NR2B 基因表達(dá)的影響(RT-PCR)

Y 迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后立即斷頭處死大鼠，于冰臺(tái)上分離雙側(cè)海馬，立即裝入EP 管中置于液氮保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)NR1(GenBank NM_017010.1)和NR2B cDNA 序列(GenBank M91562.1)，采用Primer Premier 5.0 軟件自行設(shè)計(jì)引物，NR1:Sense:5’-TCGGTATCAGGAATGCG-3’;Anti-sense:5’-GGTGCTCGTGTCTTTGG-3 ’，328bp;NR2B:5 ’-GCTCAGCGACCTGTATGG-3’，Anti-sense:5’-TCGTCACTGCGTTCTTTGT-3’，381bp;β-actin:Sense:5’-CTGAGAGGGAAATCGTGCGT-3’，Anti-sense:5’-TGGAAGGTGGACAGTGAGGC-3’，448bp。PCR 反應(yīng)條件見(jiàn)表1。

表1 PCR 反應(yīng)條件

RNA 提取方法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.8%瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射儀下觀察結(jié)果，圖像采用Image J 分析軟件進(jìn)行處理。以目的基因條帶的綜合光密度與β-actin 基因條帶綜合光密度的比值作為目的基因的相對(duì)含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 10.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，不同組別間的基因表達(dá)含量及Y 迷宮實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠麻醉誘導(dǎo)與復(fù)蘇時(shí)間及一般生理指標(biāo)的變化

大鼠麻醉及復(fù)蘇期間狀態(tài)平穩(wěn)，體溫、呼吸頻率、心率和血壓均無(wú)明顯變化。復(fù)合麻醉組麻醉起效時(shí)間(翻正反射消失時(shí)間)為3.12±0.25min，自然復(fù)蘇時(shí)間為72.25±12.15min;催醒組大鼠麻醉起效時(shí)間為3.28±0.29min，給予拮抗劑后復(fù)蘇時(shí)間為23.25±5.78min，較復(fù)合麻醉組復(fù)蘇時(shí)間明顯縮短(P＜0.01)。

2.2 麻醉誘導(dǎo)對(duì)大鼠認(rèn)知功能的影響

大鼠Y 迷宮認(rèn)知功能的測(cè)定見(jiàn)表1。由表1 可以看出，復(fù)合麻醉組與正常對(duì)照組相比，正確反應(yīng)率有所下降(P＜0.01)，拮抗劑催醒組與復(fù)合麻醉組相比，正確反應(yīng)率明顯升高(P＜0.01)。提示芬太尼、咪達(dá)唑侖復(fù)合麻醉對(duì)大鼠短期內(nèi)(1w)學(xué)習(xí)記憶能力有一定損害作用，麻醉后給予拮抗劑催醒對(duì)麻醉導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶能力下降有明顯的改善作用。

2.3 麻醉誘導(dǎo)與藥物催醒對(duì)NR1、NR2B 基因表達(dá)的影響

麻醉誘導(dǎo)與拮抗劑催醒對(duì)NR1、NR2B 基因表達(dá)的影響結(jié)果見(jiàn)表2。由表2 可以看出，復(fù)合麻醉組與正常對(duì)照組相比，大鼠海馬組織內(nèi)NR2B mRNA 表達(dá)量顯著降低(P＜0.01)，催醒組NR2B mRNA 表達(dá)量與復(fù)合麻醉組相比顯著升高(P＜0.01)，與正常對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。NR1 mRNA 表達(dá)量在各組間均無(wú)明顯變化。說(shuō)明芬太尼、咪達(dá)唑侖復(fù)合麻醉可降低海馬部位的NR2B 的mRNA 表達(dá)，使用拮抗劑催醒可顯著增加海馬部位的NR2B 的mRNA 表達(dá)。

表1 各組大鼠Y 迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果(±s)

表1 各組大鼠Y 迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果(±s)

與對(duì)照組比較＊＊P＜0.01;與復(fù)合麻醉組比較##P＜0.01

表2 麻醉誘導(dǎo)與拮抗劑催醒對(duì)大鼠海馬NR1、NR2B mRNA 表達(dá)的影響(±s)

表2 麻醉誘導(dǎo)與拮抗劑催醒對(duì)大鼠海馬NR1、NR2B mRNA 表達(dá)的影響(±s)

與對(duì)照組比較＊＊P＜0.01;與復(fù)合麻醉組比較##P＜0.01

3 討論

越來(lái)越多的證據(jù)表明，全身麻醉后大腦發(fā)生了基因表達(dá)改變［3］、β 淀粉樣沉積［4］、神經(jīng)元凋亡［5，6］等廣泛而持久的變化，單純的短時(shí)間麻醉即可造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物長(zhǎng)時(shí)間的認(rèn)知功能障礙［7～9］，臨床上常常表現(xiàn)為術(shù)后認(rèn)知功能障礙(POCD)。Moller 等［10］在一項(xiàng)臨床調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，10%～14%的老年患者全身麻醉或手術(shù)后發(fā)生了長(zhǎng)期的認(rèn)知功能障礙。而中年和青年患者術(shù)后1 至2w 的認(rèn)知功能障礙也有很高的發(fā)生率［11］。咪達(dá)唑侖是一種常見(jiàn)靜脈麻醉藥物，是當(dāng)前臨床應(yīng)用的唯一的水溶性苯二氮艸卓類藥物，臨床上常與芬太尼類化合物配伍使用。研究發(fā)現(xiàn)，鎮(zhèn)靜劑量的咪達(dá)唑侖可以抑制大鼠的記憶獲得和鞏固并維持較長(zhǎng)一段時(shí)間［12］，大鼠腹腔注射咪達(dá)唑侖可出現(xiàn)東莨菪堿所致的認(rèn)知功能障礙加重的現(xiàn)象［13］，因此認(rèn)為咪達(dá)唑侖可能是導(dǎo)致POCD 的一個(gè)重要因素。芬太尼是一種強(qiáng)效麻醉性鎮(zhèn)痛藥，屬于阿片受體激動(dòng)劑，與咪達(dá)唑侖在鎮(zhèn)痛、催眠作用上具有一定的協(xié)同作用，可減少單一藥物的用藥劑量，減輕不良反應(yīng)［14］。本研究采用Y 迷宮實(shí)驗(yàn)觀察了芬太尼和咪達(dá)唑侖麻醉后對(duì)大鼠認(rèn)知功能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，芬太尼、咪達(dá)唑侖復(fù)合麻醉后7d 內(nèi)大鼠逃避傷害刺激的正確反應(yīng)率有所下降(P＜0.01);拮抗劑催醒組與復(fù)合麻醉組相比，正確反應(yīng)率明顯升高(P＜0.01)。提示芬太尼、咪達(dá)唑侖復(fù)合麻醉短期內(nèi)對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力即認(rèn)知功能有一定損害作用，麻醉后快速給予納洛酮(阿片受體拮抗劑)和氟馬西尼(苯二氮艸卓類受體拮抗劑)催醒對(duì)麻醉導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶能力下降有明顯的改善作用。

谷氨酸是哺乳動(dòng)物腦內(nèi)最重要的一種興奮性氨基酸，其參與長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)的產(chǎn)生和大腦的興奮性傳遞，對(duì)大腦的學(xué)習(xí)記憶能力起重要作用。而谷氨酸主要是通過(guò)其離子型受體N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)介導(dǎo)一系列高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)，它被認(rèn)為是突觸可塑性和皮質(zhì)及海馬神經(jīng)元LTP 的主要調(diào)控者，是構(gòu)成中樞神經(jīng)系統(tǒng)學(xué)習(xí)記憶功能的重要基礎(chǔ)。NR1 是NMDA 受體復(fù)合物的功能性亞單位，是NMDA 受體通道的必要組成部分，它的含量代表了NMDA 受體的總量，NR2B 是主要的調(diào)節(jié)亞單位，可以反映NR 受體的功能變化。有研究證明:選擇性敲除小鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞的NR1 亞單位后，其NMDAR 誘導(dǎo)的LTP 被破壞，且小鼠表現(xiàn)為空間記憶障礙［15］。慢性復(fù)合應(yīng)激可通過(guò)使NR2B表達(dá)增多增強(qiáng)大鼠的學(xué)習(xí)記憶［16］。鉛中毒可導(dǎo)致海馬神經(jīng)元NR2B 表達(dá)下降并引起不同程度記憶受損［17］。敲除NR2B 基因后小鼠記憶能力下降，而移植轉(zhuǎn)染NR2B 基因可使大鼠記憶明顯增高［18］。以上說(shuō)明，NR1 和NR2B 受體的功能與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)。因此，本研究選取了NR1 和NR2B 兩種亞基進(jìn)行研究，通過(guò)觀察2 種亞基的mRNA 表達(dá)變化，間接反映NR 受體的功能，探討麻醉后認(rèn)知障礙與NMDA 受體的關(guān)系。

RT-PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)合麻醉組與正常對(duì)照組相比，大鼠海馬組織內(nèi)NR2B mRNA 表達(dá)量顯著降低(P＜0.01)，催醒組NR2B mRNA 表達(dá)量與復(fù)合麻醉組相比顯著升高(P＜0.01)，與正常對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。NR1 mRNA 表達(dá)量在各組間均無(wú)明顯變化。說(shuō)明芬太尼、咪達(dá)唑侖復(fù)合麻醉可降低海馬部位的NR2B 的mRNA 表達(dá)，使用拮抗劑催醒可顯著增加海馬部位的NR2B 的mRNA 表達(dá)。該結(jié)果與大鼠Y 迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，提示海馬組織內(nèi)NR2B 表達(dá)下降可能與認(rèn)知障礙的產(chǎn)生關(guān)系密切，該結(jié)果與以往研究相一致［19，20］。NR1 基因表達(dá)在認(rèn)知障礙大鼠并未出現(xiàn)表達(dá)改變，研究推測(cè)NR1基因在認(rèn)知過(guò)程的形成中起著必不可少的作用，但是認(rèn)知障礙的形成可能主要由調(diào)節(jié)亞單位NR2B 的變化引起，NR2B 基因可能起著調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶功能的重要作用。具體NMDA 受體在認(rèn)知障礙的形成過(guò)程中行使何種功能，各亞型之間存在何種相互作用，NMDA 受體與其他受體蛋白是否存在交互作用，具體機(jī)制如何將是我們下一步研究的方向。

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