孫凱峰,王 娜,劉莉莉,段舜山

(暨南大學水生生物研究中心,廣東普通高校水體富營養(yǎng)化與赤潮防治重點實驗室,廣東 廣州 510632)

據(jù)報道,歐盟2008年和中國2005年農(nóng)藥噴灑量分別達到了14萬t和100萬t以上,然而經(jīng)濟利益驅(qū)使下的不合理甚至是隨意濫用導致的農(nóng)藥殘留卻帶來了嚴重的生態(tài)環(huán)境危害及食品安全問題[1-3].有機磷農(nóng)藥隨農(nóng)業(yè)灌溉、雨水沖刷、淋溶等過程進入構(gòu)成水域生態(tài)系統(tǒng)門戶的池塘、河流等水體并對“非靶目標生物”作用相關(guān)的研究已有大量報道[4-7].高濃度有機磷農(nóng)藥殘留對浮游植物的毒害作用可概括為：抗氧化系統(tǒng)傷害、光合作用受抑制、胞內(nèi)生化組分合成受阻、遺傳物質(zhì)合成破壞等[8-10];而其對水生動物的毒害作用則主要包括神經(jīng)毒性、抗氧化系統(tǒng)損傷、行為干擾等[11-13].有機磷農(nóng)藥對初級消費者浮游動物的干擾作用間接導致了該生態(tài)系統(tǒng)浮游植物群落組成和穩(wěn)定性[8,14].同時,由于藻類耐受性差異,有機磷農(nóng)藥直接作用浮游植物導致其群落組成和結(jié)構(gòu)的變化也能夠影響生態(tài)系統(tǒng)的健康和穩(wěn)定[15-17].另外,研究者也注意到了有機磷農(nóng)藥刺激微藻生長這一現(xiàn)象并對其可能機理進行了探討[18-22].然而,藍、綠藻的“藻華”暴發(fā)的誘導因素及發(fā)生機理仍無統(tǒng)一定論[15,23-26].然而,淡水生態(tài)系統(tǒng)中存在磷限制的傳統(tǒng)觀念也引起了對有機磷類化合物作用的關(guān)注,尤其是在“藻華”暴發(fā)區(qū)域和頻率都不斷增加的狀況下.本文意在模擬一次有機磷農(nóng)藥噴灑后經(jīng)歷的高濃度殘留階段、稀釋后的中等殘留階段以及吸附沉降后的低濃度存在階段三個自然過程,探索該過程中典型微藻四尾柵藻的生理生態(tài)響應(yīng)程度.進一步揭示有機磷農(nóng)藥噴灑對水域生態(tài)系統(tǒng)中浮游植物種群動態(tài)響應(yīng)的生理機制,探索有機磷作為磷源下藻類的生理過程變化差異并為有機磷農(nóng)藥生態(tài)風險的科學、準確評估提供參考.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用的四尾柵藻(S. quadricanda)分離自暨南大學明湖“藻華”過程,采用BG-11培養(yǎng)基培養(yǎng),并保存于暨南大學水生生物研究中心藻種室.BG-11培養(yǎng)基主要成分和含量分別是：NaNO3,K2HPO4,MgSO4·7H2O,CaCl2·2H2O,Na2CO3,EDTANa2,檸檬酸,檸檬酸鐵銨溶液,微量元素,其工作液含量分別為 1.5,0.04,0.075,0.036,0.02,0.001,0.006,0.006g/L.

實驗用市售毒死蜱濃度為40%(博樂牌)、草甘膦異丙胺鹽濃度為41%(農(nóng)達).有機磷農(nóng)藥使用前配置,實驗中的藥物濃度均按照P原子摩爾質(zhì)量設(shè)定.

1.2 實驗設(shè)計及培養(yǎng)條件

高濃度毒死蜱和草甘膦對四尾微藻生長的毒性效應(yīng)實驗：參考藻類急性毒性試驗要求,將處于指數(shù)期的微藻接種到新鮮培養(yǎng)基中后分裝到 150mL三角瓶中,然后根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果,分別添加6個濃度的農(nóng)藥后進行第二次分裝.50mL玻璃管(Schott Duran, Germany)中分裝 40mL加藥后的藻液,藻細胞起始密度為(2.6～3.0)×105個/mL.草甘膦濃度設(shè)定為：2.95,5.90,11.80,23.59,47.19,94.37μmol/L;毒死蜱濃度設(shè)定為：0.46,0.91,1.83,3.66,7.31,14.63μmol/L.每組設(shè)3個平行,并設(shè)不加藥處理組為對照.

低濃度毒死蜱和草甘膦對四尾柵藻生長的刺激效應(yīng)實驗：毒死蜱處理組藻細胞起始密度為8.5×105個/mL,濃度設(shè)定為：0.021,0.214,2.14μmol/L;草甘膦處理組藻細胞起始密度為3.8×105個/mL,濃度設(shè)定為：0.014,0.135,1.35μmol/L.將處于指數(shù)生長期的藻細胞濃縮后接種到不同濃度處理組中,然后分裝150mL藻液到200mL三角瓶中.每組設(shè)3個平行,并設(shè)不加藥處理組為對照.

磷饑餓處理后四尾柵藻在毒死蜱和草甘膦作為唯一磷源下的生長實驗：將培養(yǎng) 14d的四尾柵藻離心(3000r/min,5min,24℃)后重新接種到無菌蒸餾水進行饑餓處理3d,以消耗藻細胞體內(nèi)儲存的磷.然后將藻細胞離心濃縮后接種到不添加無機磷的BG-11培養(yǎng)液中,分裝到500mL三角瓶中加入相應(yīng)濃度的農(nóng)藥.草甘膦濃度設(shè)定為：0.13,0.27,0.40,0.54,0.67μmol/L;毒死蜱濃度設(shè)定為：0.03,0.06,0.09,0.11,0.14μmol/L.混勻后再次分裝150mL藻液到200mL三角瓶中.每組設(shè)3個平行,并設(shè)不加藥處理組為對照.

實驗在人工氣候培養(yǎng)箱(CC275TL-2H, Xutemp)中進行一次性培養(yǎng),光照強度 90μmol/ (m2·s),溫度為(24±1)℃.每天早中晚采用微型漩渦混合儀(XW-80A,江蘇)連續(xù)震蕩(2800r/min)混勻藻液,并隨機更換玻璃試管位置,以避免光照不均勻帶來的影響.

1.3 觀測指標

藻細胞數(shù)目：混勻后取樣 100μL,加入到血球計數(shù)板中,并在顯微鏡下計數(shù)全片.

藻細胞葉綠素熒光值：采用葉綠素熒光儀(TD-700,Turner Design)測定.取樣后進行20min的黑暗處理,若濃度高于檢測線則采用蒸餾水稀釋后測定.

藻細胞最大光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)：采用植物效率儀(Handy PEA, Hansatech)測定.取樣后進行20min的黑暗處理,且測樣過程也在黑暗條件下進行.

半數(shù)有效濃度(EC50)：以濃度的對數(shù)值(log10)為橫坐標,抑制率的百分數(shù)為縱坐標繪制曲線,通過回歸分析獲得相應(yīng)的回歸方程,并計算出半數(shù)有效濃度.

1.4 數(shù)據(jù)處理和分析

實驗數(shù)據(jù)匯總和繪圖 origin8.0,統(tǒng)計學分析采用SPSS 13.0進行線性回歸(Linear Regression)和單因素方差分析(One-way ANOVA),并采用LSD進行多重比較.

2 結(jié)果與分析

2.1 草甘膦和毒死蜱對四尾柵藻的毒性效應(yīng)

四尾柵藻培養(yǎng)液中添加有機磷農(nóng)藥草甘膦和毒死蜱對其生長均表現(xiàn)出顯著的劑量效應(yīng),農(nóng)藥濃度的增加,四尾柵藻的葉綠素熒光值受到的抑制效應(yīng)顯著增強(圖1).處理組四尾柵藻葉綠素熒光值受到的抑制程度與有機磷農(nóng)藥 P原子濃度(μmol/L)之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系,除草劑草甘膦和殺蟲劑毒死蜱對四尾柵藻生長的 96h EC50值分別為 12.98,2.02μmol/L.

2.2 草甘膦和毒死蜱對四尾柵藻生長和最大光能轉(zhuǎn)化效率的刺激效應(yīng)

圖1 草甘膦和毒死蜱(μmol/L)對四尾柵藻葉綠素熒光值的影響及急性毒性分析Fig.1 Effect of glyphosate and chlorpyrifos (μmol/L) on fluorescence of chlorophyll a in S. quadricanda and the inhibitory rate under series of concentrations (log C)

四尾柵藻培養(yǎng)液中添加低濃度草甘膦和毒死蜱其細胞密度和最大光能轉(zhuǎn)化效率變化如圖2所示.添加低濃度草甘膦對四尾柵藻最大光能轉(zhuǎn)化效率和細胞密度均能夠表現(xiàn)出顯著的刺激作用(圖 2).低濃度草甘膦(＜0.135μmol/L)對四尾柵藻細胞密度表現(xiàn)出顯著的刺激效應(yīng).0.014,0.135μmol/L草甘膦處理組第 6d的細胞密度分別比對照組增加了13%和10%,表現(xiàn)出顯著的刺激效應(yīng)(P＜0.05).從最大光能轉(zhuǎn)化效率上,草甘膦也表現(xiàn)出顯著的刺激作用,0.014和 1.35μmol/L草甘膦處理組第6d的促進效應(yīng)比對照組增加了6.0%和 7.1%(P＜0.05).低濃度毒死蜱對四尾柵藻細胞密度仍表現(xiàn)出了顯著的抑制效應(yīng)(圖2),而在最大光能轉(zhuǎn)化效率上,僅第5,6d時處理組高于對照組.2.14μmol/L處理組Fv/Fm比對照組增加了11.6%,表現(xiàn)出顯著的刺激效應(yīng)(P＜0.05).

圖2 低濃度草甘膦和毒死蜱(μmol/L)對四尾柵藻細胞密度和最大光能轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.2 Effect of glyphosate and chlorpyrifos (μmol/L) on cell density and Fv/Fm in S. quadricanda under low concentrations (μmol/L)

圖3 磷饑餓處理后四尾柵藻在草甘膦和毒死蜱作為唯一磷源下的葉綠素熒光和Fv/Fm變化Fig.3 Fluorescence of chlorophyll a and Fv/Fm in S. quadricanda treated with glyphosate and chlorpyrifos (μmol/L) as unique phosphorus in after phosphorus starvation in preculture

2.3 草甘膦和毒死蜱對磷缺失培養(yǎng)液中四尾柵藻磷源的替代效應(yīng)

經(jīng)過無菌蒸餾水饑餓處理3d的四尾柵藻接種到草甘膦和毒死蜱作為磷源下的生理生長情況如圖 3所示.四尾柵藻以草甘膦作為唯一磷源下的葉綠素熒光值均高于對照組,0.4μmol/L處理組在第4d比對照組增加了30.8%,表現(xiàn)出顯著促進作用.但第 6d的促進作用有所降低,僅為18.0%(圖3).從Fv/Fm變化上看,0.67μmol/L草甘膦處理組顯著減緩了Fv/Fm的降低,第2,4d分別是對照組的2.1倍和1.7倍(P＜0.05).以毒死蜱作為唯一磷源下的葉綠素熒光值在實驗中也表現(xiàn)出毒性效應(yīng),Fv/Fm僅0.03和0.06μmol/L處理組第1d比對照組增加了5.2%和16.8%(圖3).

3 討論

有機磷農(nóng)藥多為磷酸酯類或硫代磷酸酯類,基本構(gòu)型以P原子為中心連接4個取代基(R1、R2、Z、X).其中,R1、R2多為甲氧基(-CH3O)或乙氧基(-C2H5O);Z為氧(O)或硫(S)原子;X為烷氧基、芳氧基或其他取代基團.有機磷農(nóng)藥的毒性與其中心P原子的電正性直接相關(guān),取代基種類和結(jié)構(gòu)通過影響 P原子電荷分布影響其毒性效應(yīng)[7].同時,有機磷農(nóng)藥直接或分解后被藻類利用所提供的營養(yǎng)元素最主要的也是P.因此,可以根據(jù)P原子的摩爾質(zhì)量開展有機磷農(nóng)藥的生態(tài)效應(yīng)研究.

有機磷農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用可間接導致水體有機磷農(nóng)藥殘留的增加,而水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的有機磷殺蟲劑和殺菌劑的應(yīng)用可直接導致水體的有機磷農(nóng)藥污染.一次有機磷農(nóng)藥噴灑(0.15g/m2)可導致水深 30cm,表面積666.67m2水塘產(chǎn)生1μg/L的農(nóng)藥殘留[27].以磷酸酯類或硫代磷酸酯類經(jīng)典的結(jié)構(gòu)式計算其最小分子量在220左右,按照P原子計算一次農(nóng)藥噴灑后殘留的有機磷農(nóng)藥殘留量為4.55μmol/L.有機磷農(nóng)藥對淡水微藻的急性毒性效應(yīng)盡管存在種間差異,但其急性毒性濃度范圍多為μmol/L數(shù)量級.本實驗中選取的草甘膦和毒死蜱對四尾柵藻的急性毒性 96hEC50值分別為12.98μmol/L 和 2.02μmol/L,毒死蜱毒性顯著高于草甘膦.這一現(xiàn)象從化學結(jié)構(gòu)上看,毒死蜱取代基可誘導P原子產(chǎn)生高電正性,而草甘膦僅由甘氨酸異丙胺鹽取代了一個-OH;從作用特征上看,毒死蜱類殺蟲劑作用四尾柵藻主要是降低藻細胞體內(nèi)膽堿酯酶活性、產(chǎn)生抗氧化損傷、增加細胞膜通透性等[8-9,19],而草甘膦主要作用于藻細胞內(nèi)烯醇丙酮基莽草素磷酸合成酶,通過抑制莽草素向苯丙氨酸、酷氨酸及色氨酸的轉(zhuǎn)化,使蛋白質(zhì)的合成受到干擾導致植物死亡[21-22].因此,草甘膦作用的專一性也是限制其毒性強度的重要因素.

有機磷農(nóng)藥進入水體后的吸附和沉降導致其濃度逐漸降低,有研究者發(fā)現(xiàn)一定濃度的有機磷農(nóng)藥會刺激藻類的生長并可能誘發(fā)特殊條件下某些種類微藻的“水華”.有機磷農(nóng)藥對微藻的刺激作用表現(xiàn)在葉綠素和蛋白質(zhì)含量增加、DNA和RNA合成速度升高、抗氧化系統(tǒng)活性增強,光合作用速率提高以及營養(yǎng)鹽吸收速率增加等[18-20].如：低于22.7μmol/L的甲胺磷和0.34μmol/L的辛硫磷能夠促進顯著銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)的生長[23],5.2μmol/L對硫磷顯著提高了三角褐指藻的生長速率[17].本研究中也進一步證實這一現(xiàn)象,添加低濃度草甘膦能夠顯著促進四尾柵藻細胞密度增加以及最大光能轉(zhuǎn)化效率的升高,藻細胞密度和最大光能轉(zhuǎn)化效率的刺激作用最大值分別為 13%和 7%.然而,本實驗也發(fā)現(xiàn)毒死蜱在顯著低于其EC50濃度下仍未檢測出刺激作用,這可能受實驗選取觀察指標的限制或毒死蜱濃度設(shè)定的限制等.謝榮等[19]在探討丙溴磷對微藻刺激效應(yīng)和毒性作用的機理中提出了抗氧化系統(tǒng)響應(yīng)程度差異引發(fā)不同生理反應(yīng)的觀點,從污染物引發(fā)胞內(nèi)活性氧含量的程度差異以及引發(fā)脂質(zhì)過氧化水平變化上揭示有機磷農(nóng)藥的作用機制.然而,也有研究者認為藻細胞可以通過利用有機磷作為磷源,進而促進藻類的生長[24-25].辛硫磷濃度介于67.1～ 335.2nmol/L條件下可作為磷源維持滇池微囊藻的生長[23],銅綠微囊藻在無機磷缺乏的條件下易成為優(yōu)勢種,而斜生柵藻在無機磷充足條件下占優(yōu)勢[26].本實驗中,草甘膦能夠較顯著地彌補培養(yǎng)液中無機磷缺失對四尾柵藻生長的限制,然而這僅局限在較短的時間內(nèi).從最大光能轉(zhuǎn)化效率上看,所有無機磷缺失條件下的四尾柵藻光合作用均收到顯著的抑制.毒死蜱對培養(yǎng)液中無機磷缺失下四尾柵藻不僅沒有促進作用,反而表現(xiàn)出了抑制或毒害作用.

綜合以上結(jié)果,有機磷農(nóng)藥噴灑后進入水體的殘留對水體初級生產(chǎn)者浮游植物的影響以低濃度下的刺激作用為主.同時,某些種類的有機磷農(nóng)藥可一定程度上作為磷源供藻類生長所需,即可引發(fā)特殊種類微藻優(yōu)勢種的形成或“水華”的暴發(fā).另外,農(nóng)藥噴灑對初級消費者浮游動物種群的毒害作用及由此引發(fā)的攝食壓力降低在浮游植物群落結(jié)構(gòu)變化中的作用也值得關(guān)注.

4 結(jié)論

4.1 草甘膦和毒死蜱對四尾柵藻均表現(xiàn)出顯著的毒害作用,毒性強弱受P原子電正性影響顯著.

4.2 除草劑草甘膦能夠顯著刺激四尾柵藻的生長和光能轉(zhuǎn)化效率,其濃度為0.014～1.35μmol/L.

4.3 四尾柵藻能夠利用草甘膦作為唯一磷源,表明草甘膦可刺激四尾柵藻生長.

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