譚璐東 劉亞輝 王英超 (吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院肝膽胰外科，吉林 長春 130021)

肝硬化是各種慢性肝臟疾病的并經(jīng)階段，國內(nèi)外研究證實(shí)由于肝硬化、門脈高壓導(dǎo)致腸道蠕動(dòng)減慢、細(xì)菌大量繁殖、腸道屏障功能減低，細(xì)菌內(nèi)毒素入血導(dǎo)致體內(nèi)一氧化氮(NO)含量過量增加，最終使體內(nèi)血管異常擴(kuò)張。我們首先建立大鼠的肝硬化模型，測定血清中NO含量，發(fā)現(xiàn)其含量明顯增加，后給予己酮可可堿(PTX)口服，觀察兩組大鼠體內(nèi)NO含量的改變。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 雌性Wistar大鼠，清潔級，體重200～220 g，購自吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 膽總管結(jié)扎肝硬化動(dòng)物模型的建立 雌性Wistar大鼠30只，禁食12 h禁水4 h。其中20只，10%水合氯醛0.35 ml/100 g腹腔注射麻醉，仰臥于固定板上，剪去上腹部毛，沿腹正中線切開皮膚3 cm，打開腹腔，找到胃幽門部、十二指腸，在十二指腸降部找到白色有韌性的膽管，游離并在其下2根4-0絲線，靠近膽總管末端結(jié)扎，兩線間距約0.5 cm，中段離斷。其余10只為假手術(shù)組，僅打開腹腔并游離膽總管。各組動(dòng)物分別于術(shù)后40 d行肝臟病理活檢。術(shù)后120 d對兩組動(dòng)物采頸靜脈血測定血清NO含量，將手術(shù)組20只大鼠隨機(jī)分成兩組，一組給予PTX葡萄糖溶液口服，一組給予葡萄糖溶液口服。5 w后復(fù)查血清NO含量。

1.3 病理學(xué)觀察 常規(guī)石蠟切片，HE染色，光鏡觀察。

1.4 NO測定 應(yīng)用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的一氧化氮試劑盒檢測血清中NO含量。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組大鼠死亡2只，死亡原因考慮:麻醉藥物劑量過大;術(shù)后出現(xiàn)急性膽管炎或肝衰竭。其余18只大鼠正常存活。對照組大鼠未見死亡。

2.2 肝臟病理學(xué)改變 術(shù)后40 d剖腹取肝臟活檢，術(shù)中可見結(jié)扎的膽總管明顯增粗，1 ml注射器穿刺抽出黃綠色膽汁。術(shù)后病理證實(shí):與正常對照組比較，病理組織學(xué)可見彌漫增生的膽小管，大量炎癥細(xì)胞在膽小管周圍，肝細(xì)胞周圍結(jié)締組織增生假小葉形成。20只大鼠除2只死亡外，其余18只肝臟纖維化改變。見圖1。

2.3 血清NO含量 對照組大鼠共10只，生存良好，術(shù)后120 d血清NO含量(36.3±9.8)μmol/L，實(shí)驗(yàn)組大鼠共存活18只，術(shù)后120 d血清NO含量(164.7±15.9)μmol/L，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=26.40，P＜0.05)。將實(shí)驗(yàn)組大鼠隨機(jī)分成兩組，一組給予PTX葡萄糖注射液口服，一組給予葡萄糖注射液口服。5 w后取靜脈血，給予 PTX組大鼠血清 NO含量(134.1±9.5)μmol/L，給予葡萄糖組大鼠血清 NO含量(181.2±14.9)μmol/L，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.00，P＜0.05)。

圖1 肝硬化病理學(xué)改變

3 討論

肝硬化是各種慢性肝病的最終階段，我國是一個(gè)肝炎大國，以肝炎后肝硬化最為常見，因此加強(qiáng)對肝硬化的基礎(chǔ)和臨床研究是十分必要的。目前尚無十分理想的肝硬化模型，國內(nèi)多采用化學(xué)藥物、微生物、病毒等手段誘導(dǎo)大鼠肝硬化〔1〕，我院普外科于1998年采用硫代乙酰胺誘導(dǎo)大鼠肝硬化模型，但上述方法除安全性差外。我們參考國外文獻(xiàn)〔2，3〕，采取膽總管雙重結(jié)扎法建立肝硬化模型，術(shù)后病理證實(shí)肝臟假小葉形成，國外學(xué)者已對上述模型從血清生化學(xué)、病理學(xué)方面給予證實(shí)〔4〕。與以往建模方法相比，該法具有以下優(yōu)點(diǎn):①模型穩(wěn)定，膽管結(jié)扎并切斷避免了膽道再通，持續(xù)的膽汁淤積可以使肝臟病理改變持續(xù)發(fā)展;②操作簡便，無需反復(fù)給藥;③安全性高，試驗(yàn)人員及周圍動(dòng)物不需接觸病毒或化學(xué)藥物;④實(shí)驗(yàn)花費(fèi)少。因此，大鼠膽總管阻塞建立的肝硬化模型可用于肝硬化的研究及治療。

NO是細(xì)胞間信息傳遞的重要調(diào)節(jié)因子，作為第二信使和神經(jīng)遞質(zhì)有著許多不同的功能，并參與許多生理、病理過程，參與信息傳遞、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)并引起血管的擴(kuò)張〔5〕。生物體內(nèi)的NO是由底物+L-精氨酸-氧化氮合酶催化生成，人體內(nèi)已知的三種NOS分別為神經(jīng)型NOS、內(nèi)皮型NOS、誘導(dǎo)型NOS，其中前兩種在人體內(nèi)發(fā)揮生理作用，而后者在體內(nèi)一般不表達(dá)，但在內(nèi)毒素的誘導(dǎo)下可以大量表達(dá)〔6〕。肝硬化患者一方面腸黏膜充血水腫、腸道蠕動(dòng)減慢，腸內(nèi)細(xì)菌過度繁殖，產(chǎn)生大量內(nèi)毒素;另一方面腸黏膜屏障功能減低以及門體靜脈分流，細(xì)菌及內(nèi)毒素入血，刺激機(jī)體產(chǎn)生TNF-α等炎性介質(zhì)，直接或通過誘導(dǎo)肝細(xì)胞本身表達(dá)NO。近來研究表明，NO作為一種遞質(zhì)，參與了肝硬化門脈高壓癥高動(dòng)力循環(huán)狀態(tài)的形成和維持，并在其中起重要作用。誘導(dǎo)型NOS誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的NO，引起外周血管明顯擴(kuò)張，降低外周阻力，增加心排血量，即為高動(dòng)力循環(huán)。同時(shí)NO又?jǐn)U張脾靜脈及腸系膜上靜脈，導(dǎo)致門靜脈血流量增加，加重了門脈高壓癥〔7〕。

PTX是非特異磷酸二酯酶抑制劑，抑制細(xì)胞磷酸二酯酶，減少CAMP水解為5'-磷酸腺苷，使胞內(nèi)CAMP升高，抑制Ca2+內(nèi)流，防止肌動(dòng)蛋白收縮，有效降低血管通透性。另有研究表明，PTX可以減少粒細(xì)胞氧自由基的生成，減少細(xì)胞凋亡。還可以減少eNOS和iNOS的產(chǎn)生，減少NO的合成。PTX可以減少成纖維細(xì)胞增殖，有證據(jù)表明肝硬化是由于肝內(nèi)成纖維細(xì)胞增殖所致，因此該藥物亦可以用于肝硬化的患者〔8〕。

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5 秦士勇，聶培蘭，張曙光，等.肝硬化門脈高壓癥患者肝組織中一氧化氮含量和一氧化氮合酶活性的變化〔J〕.中華消化雜志，2006;26(2):130-1.

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7 Thomsen LL，Miles DW.Role of nitric oxide in tumour progression:lessons from human tumours〔J〕.Cancer Metastasis Rev，1998;17:107-18.

8 張?jiān)~俠，張桂林.己酮可可堿的藥理特性和治療用途的研究進(jìn)展〔J〕.中國臨床藥理學(xué)雜志，2008;24(1):74-7.