唐小凡 何正德 李玉民 蔣祥林

幽門螺旋桿菌 (H．pylori)感染、鹽腌食品、飲酒、吸煙等是與胃癌發(fā)生有關(guān)的主要危險(xiǎn)因素。然而，接觸同樣的危險(xiǎn)因素，卻僅有部分人發(fā)生胃癌，說明不同個(gè)體對(duì)胃癌的易感性存在差異，其遺傳學(xué)基礎(chǔ)是人類基因組DNA序列的變異性，其中最常見的是單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)［1，2］。

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶［poly(ADP ribose)polymerase，PARP］是一個(gè)能選擇性識(shí)別并結(jié)合DNA缺口的DNA結(jié)合蛋白酶，人的PARP組成一個(gè)有17個(gè)成員的大家族，其中PARP－1是原型。PARP－1基因存在多個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，其中某些位點(diǎn)被報(bào)道與惡性腫瘤的易感性相關(guān)［3］。

回族是我國的一個(gè)重要的民族。根據(jù)2000年第5次人口普查數(shù)據(jù)，甘肅回族人口為118．49萬人，居全國第二。甘肅臨夏回族自治州是全國兩個(gè)回族自治州之一?；刈逶谂R夏州境內(nèi)的總?cè)丝诩s61萬人。王德增等［4］發(fā)現(xiàn)回族胃癌患病率可能較高。其原因可能與遺傳及回族大部居住高原和飲食特點(diǎn)(冬春季節(jié)較長，多以腌菜為主)有關(guān)。蘇芳賢等［5］在3269例回族胃鏡檢查中，檢出胃癌431例，胃癌檢出率為13．2%。因此，探討回族胃癌發(fā)病機(jī)制、易感因素、治療方法及預(yù)防措施具有重要的意義。唐小凡等［6］研究表明COX－2－765G＞C和中國甘肅地區(qū)回族人群胃癌易感性增高相關(guān)。目前尚未見 PARP－1Val762Ala基因多態(tài)性與回族人群胃癌易感性方面的文獻(xiàn)報(bào)告。本研究旨在探討臨夏回族自治州回族人群中PARP－1基因多態(tài)與胃癌易感性之間關(guān)系。

資料與方法

1．一般資料:研究對(duì)象均為甘肅臨夏回族自治州居民(20歲以上，居住滿20年以上，3代無族外通婚的回族居民)。分胃癌組(200例)、正常對(duì)照組(210例)。胃癌組為2007年9月～2010年5月在甘肅臨夏及蘭州地區(qū)二級(jí)甲等以上醫(yī)院住院或接受胃鏡檢查并滿足上述條件的回族居民，均經(jīng)組織病理學(xué)確診。正常對(duì)照組:來自同一時(shí)期該地區(qū)按性別、年齡(±5歲)配對(duì)，并排除腫瘤和消化系統(tǒng)疾病的健康回族志愿者。征得研究對(duì)象同意，并采集以下信息:a．人口學(xué)特征，如年齡、性別等;b．胃癌家族史(家族中有1名以上一級(jí)親屬或2名以上二級(jí)親屬患有胃癌者為陽性);c．食腌菜史(自行擬定標(biāo)準(zhǔn)為每周≥5次，每次≥50g，≥6個(gè)月/年，連續(xù)3年以上)。經(jīng)調(diào)查，回族不吸煙、不喝酒，所以本研究未涉及吸煙、飲酒史。每位研究對(duì)象自愿貢獻(xiàn)外周靜脈血5ml(EDTA抗凝)，－70℃冰箱保存。

2．實(shí)驗(yàn)方法:研究對(duì)象的基因組DNA樣品從外周血淋巴細(xì)胞中分離。使用幽門螺桿菌IgG酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒檢測是否有H．pylori感染。擴(kuò)增引物參照文獻(xiàn)，上游引物:5'－GCCCTCTGACATGTTTCTCC－3'，下游引物5'－AAGGAGGGCACCGAACAC －3'，由 Sangon公司合成(PAGE純化)［7］。PCR擴(kuò)增在50μl反應(yīng)體系中進(jìn)行，包括10× Buffer5μl，4 × dNTPs 10mmol/L 5μl，25mmol/L MgCl26μl，引物(50μmol/L)各 1μl，Tag 酶 0．2μl，模板 3μl，去離子水 29μl。反應(yīng)條件:94℃ 預(yù)變性 5min，然后按 94 ℃30s、62℃30s、72℃45秒的順序進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物用內(nèi)切酶Tail進(jìn)行消化，酶切反應(yīng)體系為20μl，其中PCR產(chǎn)物10μl，2 ×Buffer2μl，內(nèi)切酶1μl(10 個(gè)單位)，去離子水 7μl。37℃溫育過夜。3%瓊脂糖凝膠100V電泳檢測酶切結(jié)果。酶切后Ala/Ala型無酶切位點(diǎn)，產(chǎn)生100bp一條片段;Val/Val型產(chǎn)生80bp和20bp兩條片段;Val/Ala型經(jīng)酶切后產(chǎn)生100bp、80bp和20bp 3條片段。其中20bp的片段與引物二聚體在凝膠上難以分辨。

3．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:兩組之間年齡性別差異用t檢驗(yàn)比較。χ2檢驗(yàn)比較兩組之間性別、家族史、食腌菜、H．pylori感染和各基以非條件Logistic回歸計(jì)算比值比(odds ratio，OR)及其95%可信區(qū)間(confidence interval，CI)評(píng)價(jià)各基因型與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。所用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件為SPSS 13．0。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)概率檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0．05。p＜0．05為差異具有顯著性。

結(jié) 果

1．胃癌組與正常對(duì)照組在家族史、食腌菜、H．pylori感染率方面的比較:胃癌組與正常對(duì)照組比較，家族史陽性率、食腌菜、H．pylori感染率均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0．000)(表 1)。

表1 胃癌組與正常對(duì)照組在家族史、食腌菜、H．pylori感染率方面的比較［n(%)］

2．基因型頻率分布及與胃癌的關(guān)系:表2所示PARP－1 Val762Ala的基因型頻率分布均符合Hardy－Weinberg平衡規(guī)律(P=0．348，0．067)。PARP －1 762Val/Ala、Ala/Ala分別與Val/Val比較，兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)，但Val/Ala+Ala/Ala在胃癌組顯著增高(P=0．020)。

3．基因型的分層分析:表3示:在年齡、性別、家族史、食腌菜分層分析中未觀察到基因型分布差異。在H．pylori感染陽性人群中，PARP－1 Val/Ala+Ala/Ala基因型患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)是Val/Val基因型的1.748 倍(OR=1．748，95%CI:1．016 ～ 3．008，P=0.043)。

表2 PARP－1基因型在3組中的分布及其與胃癌的關(guān)系［n(%)］

表3 PARP－1Val762Ala基因多態(tài)性與胃癌相關(guān)性的分層分析

4．家族史、食腌菜、H．pylori感染與 PARP－1 Val762Ala交互作用對(duì)胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的影響:分別以家族史陰性、不食腌菜、H．pylori感染陰性的正常對(duì)照組中基因型為Val/Val的個(gè)體為對(duì)照，家族史陽性的胃癌組Val/Ala+Ala/Ala基因型患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)是家族史陰性的正常對(duì)照組Val/Val基因型的4.125倍(OR=4．125，95%CI:2．117 ～8．038，P=0．000)，大于家族史陰性的胃癌組對(duì)家族史陰性的正常對(duì)照組OR值與家族史陽性的胃癌組對(duì)家族史陽性的正常對(duì)照組OR值乘積;食腌菜的胃癌組Val/Ala+Ala/Ala基因型患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)是不食腌菜的正常對(duì)照組 Val/Val基因型的 3．814 倍(OR=3．814，95%CI:2.150 ～6．766，P=0．000)，大于不食腌菜的胃癌組對(duì)不食腌菜的正常對(duì)照組OR值與食腌菜的胃癌組對(duì)食腌菜的正常對(duì)照組OR值乘積;H．pylori感染陽性的胃癌組Val/Ala+Ala/Ala基因型患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)是H．pylori感染陰性的正常對(duì)照組Val/Val基因型的4．085 倍(OR=4．085，95%CI:2．197 ～ 7．597，P=0.000)，大于 H．pylori感染陰性胃癌組對(duì) H．pylori感染陰性的正常對(duì)照組的OR值與H．pylori感染陽性的胃癌組對(duì)H．pylori感染陽性的正常對(duì)照組的OR值乘積，可見Val/Ala+Ala/Ala基因型分別與家族史、食腌菜、H．pylori感染對(duì)胃癌的發(fā)生具有加乘交互作用。

討 論

1．PARP－1 Val762Ala基因多態(tài)性與胃癌易感性:PARP－1主要通過修復(fù)DNA單鏈及雙鏈斷裂在維持基因組的完整性方面發(fā)揮作用［8］。PARP－1基因存在著豐富的單核苷酸多態(tài)性，尤其是Val762Ala位點(diǎn)的多態(tài)可下調(diào)酶的活性，與人類多種腫瘤相關(guān)［9］。Shiokawa 等［10］在人類生殖腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了PARP－1 Val762Ala的基因多態(tài)性。Zhang等［11］的研究顯示在中國漢族人群中，PARP－1 Val762Ala多態(tài)與吸煙相關(guān)的肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增高相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)攜帶PARP－1 Val/Ala+Ala/Ala基因型的個(gè)體患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)是Val/Val攜帶者的2.158倍(P=0．020)。胃癌組的Ala等位基因頻率明顯高于正常對(duì)照組的Ala等位基因頻率(P=0．000)。通過數(shù)據(jù)分析，我們認(rèn)為PARP－1 Val762Ala多態(tài)性與臨夏回族自治州回族胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。

2．胃癌家族史、食腌菜、H．pylori感染與 PARP－1 Val762Ala的交互作用對(duì)胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的影響:胃癌有明顯的家族聚集現(xiàn)象，家族發(fā)病率高于人群2～3倍［12，13］。一般認(rèn)為遺傳素質(zhì)使致癌物質(zhì)對(duì)易感者更易致癌，人體對(duì)內(nèi)外源性致癌劑的代謝能力和基因修復(fù)能力等因素將影響個(gè)體對(duì)胃癌的易感性。本研究發(fā)現(xiàn)胃癌組的家族史陽性率高于正常對(duì)照組(P=0．000)。交互作用分析證明 PARP－1 Val/Ala+Ala/Ala基因型與家族史對(duì)胃癌的發(fā)生具有加乘交互作用。

李玉民等［14］研究發(fā)現(xiàn)腌菜中亞硝基化合物含量較高，經(jīng)常食用腌菜人群的胃液中的硝酸鹽和亞硝酸鹽含量均明顯高于不常食用者。硝酸鹽和亞硝酸鹽可在胃內(nèi)經(jīng)細(xì)菌作用形成直接致癌的亞硝酰胺，它可以與DNA高分子結(jié)合導(dǎo)致基因突變。張龍杰等［15］研究表明腌菜有致癌作用，因?yàn)樵擃愂澄镏泻写罅康膩喯跛猁}，在胃中可轉(zhuǎn)化為強(qiáng)致癌化合物。本研究發(fā)現(xiàn)在胃癌組食腌菜的比例(42．0%)明顯高于正常對(duì)照組(21．4%)。交互作用分析發(fā)現(xiàn)PARP－1 Val/Ala+Ala/Ala與食腌菜對(duì)于胃癌的發(fā)生具有加乘交互作用。

H．pylori是引發(fā)胃癌的主要因素之一。1994年國際癌癥研究中心將H．pylori列為Ⅰ類致癌因子。H．pylori在世界范圍感染率高達(dá)50%左右，我國不同地區(qū)、不同民族人群胃內(nèi)H．pylori檢出率為30% ～80%。H．pylori感染可能引起胃黏膜上皮細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)的改變，產(chǎn)生致癌物及毒素，甚至引起基因及其表達(dá)異常。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)H．pylori感染中的Cag(+)與PARP－1762Ala/Ala基因型共同促進(jìn)了胃癌的發(fā)生和發(fā)展。PARP－1的Val762Ala的基因變異可導(dǎo)致PARP－1酶活性下降，修復(fù)DNA損傷的能力降低。本研究發(fā)現(xiàn)PARP－1 Val/Ala+Ala/Ala基因型與H．pylori感染對(duì)胃癌的發(fā)生具有加乘交互作用。

由于涉及癌變過程的基因－基因、基因－環(huán)境因素相互作用關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜，因此，本研究所獲得的這一結(jié)果有待于進(jìn)一步擴(kuò)大研究因素進(jìn)行深入研究和探討。

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