李茂強(qiáng) 朱六龍 邊振宇 季 成 陸 凱

骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，往往由多種因素引起。研究表明尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase－type plasminogen activator，uPA)及其受體可能與骨關(guān)節(jié)炎軟骨降解有關(guān)，而組織型纖溶酶原激活物(tissue plasminogen actor，tPA)可能只參與局部纖溶平衡［1］。纖溶酶原激活物抑制因子(plasminogen activator inhibitor，PAI)對 uPA、tPA 有明顯的抑制作用，但PAI在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中的作用尚不明確，我們對滑膜中的兩種PAI進(jìn)行檢測，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，探討其在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制中的作用。

材料與方法

1．材料:選取2008年1月～2010年1月在筆者醫(yī)院行關(guān)節(jié)鏡清理術(shù)的40例骨關(guān)節(jié)炎患者，其中男性11例，女性29例，年齡37～74(59．6±6．40)歲;所有患者均經(jīng)臨床及關(guān)節(jié)鏡確診，符合Altman診斷標(biāo)準(zhǔn)。10例膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷后行關(guān)節(jié)鏡診治術(shù)的患者做為對照組，既往無骨關(guān)節(jié)炎病史，關(guān)節(jié)鏡下無骨關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)，其中男性8例，女性2例，年齡36～64(50．7±9.87)歲。兩組患者均于關(guān)節(jié)鏡術(shù)中用髓核鉗取關(guān)節(jié)滑膜3～5片，每片約2mm×3mm×1mm。

2．試劑和儀器:①一抗兔抗人 PAI－1、PAI－2、uPA、tPA多克隆抗體均購自武漢博士德公司，SP免疫組化試劑盒和DAB顯色劑購自福州邁新公司;②主要儀器:關(guān)節(jié)鏡(Stryker 597T型)、石蠟切片機(jī) (Leica2135型)、恒溫干燥箱(HG303型)、顯微鏡(OlympusCX31RBSF型)、微波爐(NNK 653S型)。

3．方法:所有組織標(biāo)本一經(jīng)取下立即用10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，5μm連續(xù)切片，分別行HE染色和PAI－1、PAI－2、uPA、tPA蛋白SP法免疫組化染色。結(jié)果判斷:①結(jié)合HE染色切片，根據(jù)蘇木素復(fù)染后的細(xì)胞形態(tài)，鑒別滑膜中的不同細(xì)胞類型;②用乳腺癌作陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞膜上出現(xiàn)明顯的棕色或棕黃色顆粒為陽性;③參照Szekanecz等［2］方法，根據(jù)10×40倍高倍鏡視野下滑膜組織中的陽性細(xì)胞占全部細(xì)胞(包括滑膜襯里細(xì)胞、滑膜下層單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞)的比例計(jì)算百分比，陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)＞20%為陽性，對標(biāo)本取5個不同視野計(jì)數(shù)，取其平均值。

4．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:χ2檢驗(yàn)相關(guān)性分析，以p＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．PAI－1在關(guān)節(jié)滑膜中的表達(dá):PAI－1陽性表達(dá)反應(yīng)定位于細(xì)胞質(zhì)，呈黃色或棕黃色顆粒。40例骨關(guān)節(jié)炎滑膜中，PAI－1蛋白表達(dá)陽性26例，陽性表達(dá)率65%;10例對照滑膜中，PAI－1陽性1例(10%)。兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0．05)，陽性細(xì)胞主要分布在滑膜襯里細(xì)胞，亦可見于滑膜下層單核細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞(圖1A)。

2．PAI－2在關(guān)節(jié)滑膜中的表達(dá):PAI－2陽性表達(dá)反應(yīng)定位于細(xì)胞質(zhì)，呈黃色或棕黃色顆粒。40例骨關(guān)節(jié)炎滑膜中，PAI－2蛋白陽性25例，陽性表達(dá)率62．5%。10例對照滑膜中，PAI－2陽性 1例(10%)，并且著色較淡。兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0．05)，陽性細(xì)胞主要分布在滑膜襯里細(xì)胞(圖1B)。

3．uPA在關(guān)節(jié)滑膜中的表達(dá):uPA陽性表達(dá)反應(yīng)定位于細(xì)胞質(zhì)，呈黃色或棕黃色顆粒(圖1C)。40例骨關(guān)節(jié)炎滑膜中，uPA蛋白陽性31例，陽性表達(dá)率77．5%。

4．tPA在關(guān)節(jié)滑膜中的表達(dá):tPA陽性表達(dá)反應(yīng)定位于細(xì)胞質(zhì)，呈黃色或棕黃色顆粒(圖1D)。40例骨關(guān)節(jié)炎滑膜中，tPA蛋白陽性37例，陽性表達(dá)率92．5%。

圖1 骨關(guān)節(jié)炎滑膜免疫組織化學(xué)染色(SP法，×400)

5．PAI－1與uPA蛋白表達(dá):陽性細(xì)胞百分比呈直線正相關(guān)(r=0．630，P ＜0．01);PAI－1 與 tPA 蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞百分比呈直線正相關(guān)(r=0．417，p＜0.01);PAI－2與uPA、tPA蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞百分比無直線相關(guān)關(guān)系。

討 論

絲氨酸蛋白酶通過多種方式促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)和基膜的降解，參與纖溶、炎癥、細(xì)胞遷移等多種生理病理過程，uPA、tPA均屬于絲氨酸蛋白酶。在骨關(guān)節(jié)炎中，uPA對軟骨的降解在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，而PAI是uPA、tPA的天然抑制因子，我們通過免疫組化的方法，觀察PAI在骨關(guān)節(jié)炎滑膜中的表達(dá)，探討其在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中的作用。

PAI－1和PAI－2是正常血漿中纖溶酶原激活物(plasminogen activator，PA)的主要抑制因子，以PAI－1更為重要。PAI－1是由379個氨基酸組成的糖蛋白，分子質(zhì)量約50kDa，能快速與uPA、tPA結(jié)合，抑制其活性，是人體纖溶系統(tǒng)的主要調(diào)節(jié)因子。關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等均能合成PAI－1和PAI－2，主要作用是維持局部PA/PAI系統(tǒng)的平衡［3］。IL－1、IL －6、TNF － α、粒細(xì)胞 － 巨噬細(xì)胞集落因子(GM－CSF)可在局部影響 PAI產(chǎn)生［4］。

研究表明，骨關(guān)節(jié)炎滑膜中uPA的表達(dá)與軟骨降解的程度密切相關(guān)，而PAI作為uPA的抑制因子，與軟骨降解之間的關(guān)系還未完全闡明［5］。本研究觀察到骨關(guān)節(jié)炎滑膜襯里層細(xì)胞可見PAI－1和PAI－2陽性表達(dá)，滑膜下層細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及單核－吞噬細(xì)胞亦出現(xiàn)陽性表達(dá)。雖然對照滑膜也檢測到其陽性表達(dá)，但強(qiáng)度較弱，并且陽性率與骨關(guān)節(jié)炎滑膜差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示PAI和骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)系密切，可能在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。

通過相關(guān)性分析，PAI－1與uPA、tPA蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞百分比呈直線正相關(guān);PAI－2與uPA、tPA蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞百分比無直線相關(guān)關(guān)系。提示PAI，尤其是PAI－1在骨關(guān)節(jié)炎滑膜中維持PA/PAI平衡具有重要作用。PAI的增加是與PA系統(tǒng)相互作用的結(jié)果，骨關(guān)節(jié)炎滑膜中PA/PAI系統(tǒng)失去平衡后，PA增高，通過機(jī)體的反饋，導(dǎo)致PAI的增高，以適應(yīng)局部的PA增高，在高水平達(dá)到新的平衡。PAI也對uPA有重要調(diào)節(jié)作用，與uPA和uPAR結(jié)合成復(fù)合物，通過細(xì)胞內(nèi)吞作用，使uPA在溶酶體中降解，uPAR再次循環(huán)至細(xì)胞表面表達(dá)，通過此途徑可調(diào)節(jié)uPA的分泌和uPAR的表達(dá)。PAI和PA的相互作用，使PA/PAI處于一種動態(tài)平衡，致使組織降解不至于過于劇烈，骨關(guān)節(jié)炎的軟骨降解表現(xiàn)為長期慢性的過程可能與此有關(guān)。

研究表明，PAI具有許多獨(dú)立于PA的功能，如對血管生成的調(diào)節(jié)等。PAI在骨關(guān)節(jié)炎中表達(dá)的調(diào)控，亦可能有其獨(dú)立的激活機(jī)制，參與骨關(guān)節(jié)炎的形成及發(fā)展。

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5 李茂強(qiáng)，李寬新，史晨輝，等．骨關(guān)節(jié)炎滑膜的uPA表達(dá)與關(guān)節(jié)軟骨破壞程度的相關(guān)研究［J］．中國內(nèi)鏡雜志，2006，12(24):29－31