秦文燕 曹群奮 李昌平

肝纖維化是大多數(shù)慢性肝病所共有的病理特征，也是慢性肝炎進(jìn)一步向肝硬化和肝癌發(fā)展的重要環(huán)節(jié)［1］。而肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)的活化增殖是肝纖維化形成的主要細(xì)胞基礎(chǔ)，細(xì)胞外基質(zhì)(extra cellular matrix，ECM)的大量合成是肝纖維化形成的直接原因，也是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)［2］?；罨腍SC主要通過凋亡機(jī)制減少，故促進(jìn)HSC凋亡可逆轉(zhuǎn)肝纖維化［3］。鑒于HSC在肝纖維化發(fā)病機(jī)制中的主導(dǎo)作用，大多數(shù)抗肝纖維化研究都以HSC為靶標(biāo)。所以，抑制HSC的活化和增殖，促進(jìn)HSC的凋亡，成為治療肝纖維化的基本策略。已有實(shí)驗(yàn)證明舒肝顆?？赏ㄟ^抑制HSC增殖和膠原蛋白的分泌，減少膠原纖維在肝臟內(nèi)的沉積，但它是否具有促進(jìn)肝星狀細(xì)胞凋亡，及其可能的作用機(jī)制，未曾進(jìn)行過研究，故本實(shí)驗(yàn)選擇觀察舒肝顆粒作用于體外培養(yǎng)的活化的大鼠肝星狀細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測結(jié)果［4］。

肝星狀細(xì)胞凋亡機(jī)制較為復(fù)雜，可通過多途徑凋亡。目前，國內(nèi)外對中藥誘導(dǎo)HSC凋亡的研究實(shí)驗(yàn)已逐漸展開，而中藥具有多層次、多靶點(diǎn)的抗纖維化作用，且不良反應(yīng)少，價(jià)格低廉，擁有廣闊的前景，值得我們深入研究和實(shí)踐。HSC凋亡途徑主要包括:①經(jīng)典的線粒體途徑;② 死亡受體途徑:包括Fas/FasL途徑、腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)途徑和腫瘤壞死因子－α(TNF－α)途徑;③非死亡受體途徑。本實(shí)驗(yàn)選擇死亡受體途徑及Bcl家族蛋白兩條途徑，對舒肝顆粒可能誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞凋亡的機(jī)制進(jìn)行探討。

材料與方法

1．實(shí)驗(yàn)材料:肝星狀細(xì)胞株HSC－T6，購自上海中醫(yī)藥大學(xué)肝病研究所，其表型為活化的HSC。舒肝顆粒由瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥物研究所提供、特級胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所，Annexin－v/FITC抗體購自Beckman公司，CD95抗體、Bax抗體、Bcl－2抗體購自Sant Cruz Biotechnoloyg公司，濃縮型DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

2．實(shí)驗(yàn)方法:(1)舒肝顆粒的配制:參照楊玲等［5］方法，由于直接加藥法和含藥血清法所得結(jié)果一致。取舒肝顆粒10g，用178ml蒸餾水溶解，裝入250ml玻璃瓶中，高壓蒸氣滅菌，用0．45μm的濾器除菌及雜質(zhì)，取100ml濾液，其濃度56mg/ml，再用0．22μm的濾器過濾除菌分裝。(2)實(shí)驗(yàn)分組:實(shí)驗(yàn)組:肝星狀細(xì)胞10%特級胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液中加入舒肝顆粒藥液，參照李志等［4］研究結(jié)果，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)情況，設(shè)置3個(gè)藥物濃度組，分別:4.2mg/ml舒肝顆粒組;2.8mg/ml舒肝顆粒組;1．4mg/ml舒肝顆粒組。對照組:肝星狀細(xì)胞10%特級胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液中不加其他處理因素。(3)HSC－T6的復(fù)蘇與培養(yǎng):從液氮罐中取出細(xì)胞凍存管，迅速置入37℃水浴中，輕輕振蕩至凍存液完全溶解(1～2min)。75%乙醇擦拭凍存管后打開，將凍存液吸入15ml無菌離心管中，邊滴加含10%PBS的DMEM培養(yǎng)基邊振蕩混勻。1000r/min離心5min，吸棄上清液，重復(fù)洗1次，再加入含10%PBS的RPMI 1640培養(yǎng)基3ml，接種于25ml培養(yǎng)瓶中，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后，更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞將近長滿培養(yǎng)瓶底時(shí)，用0．25%胰蛋白酶消化，按1∶3傳代。(4)流式細(xì)胞儀檢測舒肝顆粒對肝星狀細(xì)胞凋亡的影響:細(xì)胞復(fù)蘇后，胰酶消化、離心、吹打、計(jì)數(shù)、調(diào)整細(xì)胞濃度5×104左右，接種六孔板，培養(yǎng)1天，分組加藥，繼續(xù)培養(yǎng)24h，鏡下觀測細(xì)胞形態(tài)的變化。然后分別按實(shí)驗(yàn)組和對照組進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，每組選4個(gè)復(fù)孔，行5次檢測。具體如下:吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，收集細(xì)胞液，1500r/min離心，冷PBS沖洗，再離心，丟棄上清液，每根試管中加入100μl冷PBS，振蕩器振蕩搖勻成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度1×106/ml，緩沖液稀釋1∶4(4ml結(jié)合緩沖液加16ml去離子水)，取100μl細(xì)胞懸液，于5ml流式管中加入5μl Annexin V/FITC和10μl 20mg/ml碘化丙錠 (propidine iodide，PI)，混勻后室溫避光孵育15min，在反應(yīng)管中加入400μl PBS上機(jī)分析。(5)流式細(xì)胞儀檢測舒肝顆粒對CD95的影響:方法如上述，細(xì)胞復(fù)蘇后，接種六孔板，培養(yǎng)一天，按實(shí)驗(yàn)組和對照組分別加藥，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，鏡下觀測細(xì)胞形態(tài)的變化。同樣用流式細(xì)胞儀檢測CD95表達(dá)。(6)免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測Bax、Bcl－2的表達(dá):取對數(shù)生長期細(xì)胞經(jīng)上述相同處理后接種于置有經(jīng)多聚賴氨酸處理的蓋玻片的24孔板中，置于37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長達(dá)70%融合，將細(xì)胞分4組:空白對照組、4.2mg/ml舒肝顆粒組;2．8mg/ml舒肝顆粒組;1.4mg/ml舒肝顆粒組。以無血清培養(yǎng)基洗細(xì)胞3次，加入不同濃度舒肝顆粒。舒肝顆粒處理24h后，采用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min，0．3%Tri－tonX －100通透細(xì)胞 30min，3%過氧化氫－甲醇液中浸泡10min，非免疫性動(dòng)物血清中孵10min，加一抗(Bax抗體)4℃冰箱過夜后，生物素標(biāo)記的二抗中孵育10min，加HRP標(biāo)記鏈親和素孵育10min(以上每次操作均用PBS洗細(xì)胞3次后再進(jìn)行下一步)。然后進(jìn)行DAB顯色(顯微鏡下觀察掌握顯色程度):自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，照相。以PBS代替一抗作陰性對照實(shí)驗(yàn)。同樣的方法檢測Bcl－2表達(dá)。Bax、Bcl－2陽性結(jié)果判斷:陽性信號為棕黃色或棕褐色，位于細(xì)胞質(zhì)的線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜及核膜上，用Imge plus 7．0版專業(yè)圖像處理軟件半定量分析系統(tǒng)對各組肝星狀細(xì)胞Bax和Bcl－2反應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行顯微圖像分析，每組隨機(jī)檢測4個(gè)視野細(xì)胞的光密度，計(jì)算其積分光密度，并計(jì)算出Bax/Bcl－2的比值。

結(jié) 果

1．舒肝顆粒對肝星狀細(xì)胞凋亡的影響:從FITC和PI熒光雙參數(shù)點(diǎn)圖觀察到，對照組HSC－T6細(xì)胞主要分布在3區(qū)，因操作等原因引起的機(jī)械性死亡細(xì)胞數(shù)量非常少(＜2%)。正常對照組(n=20)的凋亡率是3.40% ±0．82%，不同濃度的舒肝顆粒1.4mg/ml(n=20)、2.8mg/ml(n=20)、4.2mg/ml(n=20)組，對應(yīng)的肝星狀細(xì)胞的凋亡率分別是:42.61%±6.42%、61.07% ±3.19%、87.84% ±5.49%。在1.4mg/ml組，肝星狀細(xì)胞的早期凋亡率明顯較正常對照組增加，而中晚期凋亡率較少。在2．8mg/ml組，肝星狀細(xì)胞的早期凋亡率和中晚期凋亡率均明顯升高。4．2mg/ml組，肝星狀細(xì)胞在舒肝顆粒作用24h后，大部分已屬于中晚期凋亡，早期凋亡較低濃度組明顯減少，但較正常對照組仍明顯增高，從早期凋亡和中晚期凋亡的總體趨勢看，隨著濃度增高，總的凋亡率增加，且各組間的差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2847．115，P ＜0．01)，具體見圖 1。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測舒肝顆粒對HSC凋亡的作用

2．舒肝顆粒對肝星狀細(xì)胞表達(dá)CD95的影響:活化的大鼠肝星狀細(xì)胞經(jīng)不同濃度的舒肝顆粒作用24h后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測熒光標(biāo)記的CD95的表達(dá)率。正常對照組(n=20)的 CD95的表達(dá)率是0.10% ±0．04%，不同濃度的舒肝顆粒1．4mg/ml(n=20)、2．8mg/ml(n=20)、4．2mg/ml(n=20)組，CD95 的表達(dá)分別是:4.77%±0.84%、9.44%±0.61%、24.51%±5．91%，并隨著濃度增高，CD95的表達(dá)率也增高，且各組間的差別具體統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=810．155，p＜0.05)。

3．舒肝顆粒對肝星狀細(xì)胞表達(dá)凋亡蛋白Bax/Bcl－2的影響:Bax的表達(dá)正常組為 574．17±190．97，隨著藥物濃度組的增高，Bax的表達(dá)增多，不同濃度的舒肝顆粒 1．4、2．8、4．2mg/ml，對 Bax 的表達(dá)分別是:1113．14 ± 556．74、1418．75 ± 604．05、1765．43 ±716．801，且各組間差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3．729，p＜0．05)，Bcl－2的表達(dá)，藥物濃度組與正常對照組無明顯差別，(F=2．70，P ＞0．05)。但總體 Bax/Bcl－2的比值隨著藥物濃度組的增加而升高，具體見表1及圖2。

表1 不同濃度的舒肝顆粒作用HSC后Bax和Bcl－2的IOD值及Bax/Bcl－2比值

圖2 Bax表達(dá)(SABC，×400)

討 論

HSC是一種主要合成分泌細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和膠原酶的間質(zhì)細(xì)胞。激活的HSC的減少主要不是通過轉(zhuǎn)化為靜止的HSC實(shí)現(xiàn)，而是凋亡的結(jié)果。HSC凋亡是導(dǎo)致HSC數(shù)量減少的中心環(huán)節(jié)。促進(jìn)HSC凋亡有利于肝纖維化的逆轉(zhuǎn)并可能成為未來抗肝纖維化的突破口?，F(xiàn)研究表明HSC凋亡是轉(zhuǎn)化依賴性的，即轉(zhuǎn)化中與激活后的HSC才能發(fā)生凋亡并且與激活程度相平行［6］。本實(shí)驗(yàn)所采用的是激活后的HSC，這符合肝纖維化中HSC的狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，舒肝顆粒在1．4～4．2mg/ml濃度范圍內(nèi)，舒肝顆粒無細(xì)胞毒性作用，能誘導(dǎo)HSC凋亡，其作用呈劑量依賴性。1．4mg/ml舒肝顆粒作用HSC－T6 24h，流式細(xì)胞儀檢測Annexin V單陽性細(xì)胞即凋亡細(xì)胞開始增多，至4．2mg/ml時(shí) Annexinv及PI雙陽性細(xì)胞即壞死細(xì)胞也開始增多。各實(shí)驗(yàn)組總的凋亡率，隨舒肝顆粒濃度的增高，而增高，各組間的差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明舒肝顆粒科誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞凋亡，且具體濃度依賴性。

肝星狀細(xì)胞可通過多途徑凋亡。激活的HSC凋亡主要通過死亡因子FasL及其相應(yīng)的死亡因子受體(Fas也稱Apo－21或CD95)介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑，它是機(jī)體內(nèi)細(xì)胞凋亡的主要途徑之一。研究發(fā)現(xiàn)，因?yàn)殡S著HSC活化的進(jìn)展，其表達(dá)Fas和FasL不斷地增加，用阻斷Fas的抗體可以完全阻止正常的和已經(jīng)進(jìn)入凋亡周期的星狀細(xì)胞繼續(xù)凋亡;用其激活抗體則可以顯著增加凋亡細(xì)胞數(shù)量［7］。為了進(jìn)一步探討舒肝顆粒誘導(dǎo)HSC凋亡的可能作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過流式細(xì)胞儀檢測舒肝顆粒作用24h的HSC細(xì)胞，是否有死亡因子受體CD95的表達(dá)增多。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明隨著舒肝顆粒濃度的增高，其CD95的表達(dá)明顯增強(qiáng)，各組間差別具體統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示舒肝顆粒可能是通過Fas介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)HSC凋亡。

HSC的另一條凋亡途徑Bcl－2/Bax家族，Bcl－2類為凋亡抑制因子，Bax類，為凋亡促進(jìn)因子［8］。正常時(shí)Bax類和Bcl－2類這對正負(fù)凋亡調(diào)節(jié)基因在體內(nèi)形成二聚體，處于動(dòng)態(tài)平衡之中。當(dāng)Bax的量高于Bcl－2時(shí)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，反之，細(xì)胞存活。本實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)隨著舒肝顆粒的濃度增高Bax的表達(dá)明顯增加，而Bcl－2的表達(dá)在正常對照組較少，隨著舒肝顆粒的濃度組增高，Bcl－2的變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而Bax/Bcl－2的比值明顯增高，促進(jìn)了HSC的凋亡，考慮Bcl－2沒有明顯的減少，可能是舒肝顆粒誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞凋亡的機(jī)制中對Bcl－2的表達(dá)無明顯影響。Elsharkawy等［3］研究也發(fā)現(xiàn)在肝纖維化逆轉(zhuǎn)中HSCs的凋亡是通過上調(diào)caspase－3、Bax實(shí)現(xiàn)的。故經(jīng)舒肝顆粒作用的HSC促凋亡蛋白表達(dá)占優(yōu)勢，對凋亡的敏感性增加而向凋亡轉(zhuǎn)化，這也可能是舒肝顆粒促進(jìn)HSC凋亡的作用機(jī)制之一。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)可以明確舒肝顆?？梢哉T導(dǎo)肝星狀細(xì)胞凋亡，且呈濃度依賴，其作用途徑可能為Fas介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途及與Bax蛋白表達(dá)上調(diào)相關(guān)。但舒肝顆粒素通過何種途徑影響HSC的Fas、Bax、P53表達(dá)，其具體機(jī)制尚不清楚，是否還通過其他信號傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)HSC的凋亡、或通過對凋亡調(diào)控基因的調(diào)節(jié)而影響HSC的凋亡，尚有待于進(jìn)一步的研究。但本實(shí)驗(yàn)為舒肝顆粒治療肝纖維化臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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