董 瑤 董飛君 李幼華

皮膚是人體最大的器官，大面積的皮膚缺損和難愈性創(chuàng)面會導致皮膚功能的喪失，其治療也是臨床上的難題。臨床治療中采用的各種自體皮片或皮瓣移植修復，會造成供區(qū)新的創(chuàng)傷。同時，供皮來源的問題也限制了其有效的應用。近年來，干細胞相關(guān)機制及應用的研究為皮膚創(chuàng)傷的治療帶來了新的突破。研究表明，間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)能夠促進皮膚創(chuàng)面的愈合，其機制包括分化為皮膚組織相關(guān)細胞［1］、促進成纖維細胞的增殖［2］、促進創(chuàng)面血管化［3］等，但其相關(guān)機制仍需要進一步闡明。本研究利用GFP－C57BL小鼠脂肪組織來源的干細胞(adipose－derived stem cells，ADSCs)用于小鼠皮膚創(chuàng)傷的治療，并探討ADSCs是否通過調(diào)節(jié)創(chuàng)面局部的炎癥反應促進創(chuàng)面愈合。

材料與方法

1．材料:DMEM(L)培養(yǎng)基、胰酶、Ⅰ型膠原酶胎牛血清、TRIzol Reagent(均購自美國Gibco公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司)，超凈工作臺(蘇州凈化總廠)，CO2培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司)，倒置顯微鏡、熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

2．GFP小鼠脂肪組織來源干細胞(ADSCs)的分離、培養(yǎng)、鑒定:取5周齡GFP轉(zhuǎn)基因小鼠(GFP－C57BL)2只，10g/L戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，75%乙醇消毒腹股溝處，無菌條件下取腹股溝部的脂肪組織約1ml，去除血管及其他組織，用青、鏈霉素的PBS反復沖洗以除去血液。用剪刀將脂肪組織剪成1mm3小塊，置于2．5ml I型膠原酶中，37℃搖床100r/min消化50min，然后800r/min離心5min，棄去上層的脂肪及上清，沉淀用含100ml/L胎牛血清的DMEM(L)培養(yǎng)基制成單細胞懸液，進行細胞計數(shù)，以2×l05/ml的密度接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、50ml/L CO2，培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，原代培養(yǎng)2天后換液，細胞長滿80%時用胰酶和EDTA消化傳代培養(yǎng)。

3．ADSCs體外向脂肪細胞和成骨細胞的誘導分化:取第3代GFP－ADSCs細胞接種于6孔板內(nèi)，用含100 ml/L FBS的DMEM(L)培養(yǎng)基培養(yǎng)，達到80%融合后分為實驗組和對照組，實驗組分別更換成脂和成骨誘導液誘導培養(yǎng)。向成骨細胞的誘導:實驗組細胞培養(yǎng)板中加入成骨誘導液培養(yǎng)(含50μmol/L抗壞血酸、10mmol/L的β－磷酸甘油鈉、0.01μmol/L的維生素D3及100ml/L FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基)，3～4天換液1次。培養(yǎng)21天時，取部分細胞爬片行茜素紅鈣鹽染色觀察礦化結(jié)節(jié)的形成。向脂肪細胞的誘導:實驗組細胞換用成脂誘導液培養(yǎng)(含1μmol/L地塞米松、10μmol/L牛胰島素、200 μmol/L吲哚美辛、0．5 μmol/L的 IBMX、10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基)，觀察細胞形態(tài)變化，21天后用4%多聚甲醛固定，油紅O染色。

4．動物移植實驗:2月齡C57BL14只，按隨機數(shù)字法分為兩組:ADSCs注射組(實驗組)及對照組。于實驗前10g/ml戊巴比妥鈉麻醉，在小鼠背部左右兩側(cè)分別制備1個直徑為1cm的圓形創(chuàng)面，完整去除全層皮膚。將5×105個ADSCs混懸于500μl PBS注射入實驗組小鼠創(chuàng)面周圍，500μl單純PBS注射入對照組小鼠創(chuàng)面周圍。術(shù)后凡士林油紗布包扎。

5．創(chuàng)面愈合情況的觀察和分析:記錄并比較分析各組1、2、3周創(chuàng)面愈合情況的差異，創(chuàng)面局部照片通過Image J軟件分析創(chuàng)面愈合率。

6．熒光顯微鏡觀察:取移植后2周實驗組與對照組動物創(chuàng)面組織的冷凍切片，用丙酮固定10min后置于濕盒中，PBS沖洗后，Hoechst33342襯染5min。熒光顯微鏡觀察移植細胞的存活情況。

7．Real－time RT－PCR檢測創(chuàng)面組織中炎癥因子的表達:分別取移植后1、2周實驗組與對照組動物創(chuàng)面區(qū)域組織，液氮冷凍環(huán)境下研磨，加入細胞裂解液(TRIzol Reagent)，常規(guī)方法提取RNA、反轉(zhuǎn)錄。IL－1、IL－6、MCP－1和β－actin的引物由Takala公司設計及合成。采用Toyobo公司熒光定量PCR試劑盒，real－time RT－PCR反應由Light Cycler Instrument(Toyobo公司)完成，RNA相對表達量的分析方法為相對CT法，β－actin設為內(nèi)參。

8．統(tǒng)計學方法:實驗數(shù)據(jù)采用SPSS13．0軟件進行t檢驗分析，以p＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義，

結(jié) 果

1．ADSCs的分離培養(yǎng)和鑒定:第1代ADSCs在倒置顯微鏡下觀察呈小多角形或短梭形并存在一些脂滴(圖1A)，經(jīng)傳代后脂滴減少。細胞持續(xù)表達GFP蛋白，在熒光顯微鏡下呈綠色熒光(圖1D)。在成脂及成骨誘導環(huán)境下，ADSCs可向成脂及成骨方向分化，出現(xiàn)油紅O陽性的脂滴(圖1B)及茜素紅陽性的礦化結(jié)節(jié)(圖1C)，證明其具有多向分化潛能。

圖1 ADSCs的培養(yǎng)及鑒定

2．ADSCs促進創(chuàng)面愈合及在創(chuàng)面區(qū)域的存活:ADSCs移植后2周，實驗組較對照組愈合情況更為良好(圖2A、B)。利用Image J軟件分析1～3周創(chuàng)面局部照片計算創(chuàng)面愈合率，在第1周和第2周，ADSCs顯著促進了實驗組創(chuàng)面愈合率(圖2C)，在第3周時實驗組與對照組的愈合率沒有顯著性差異。通過熒光顯微鏡觀察移植后2周創(chuàng)面區(qū)域組織的冷凍切片，發(fā)現(xiàn)只有少量移植ADSCs的存活(圖2D～F)。

3．ADSCs調(diào)節(jié)創(chuàng)面愈合過程中的炎癥反應:取1周和2周創(chuàng)面區(qū)域組織進行real－time PCR分析，結(jié)果顯示在上述兩個時間點，與對照組相比，實驗組創(chuàng)面區(qū)域組織中炎癥因子IL－1、IL－6顯著下降(圖3A、B);MCP－1在第1周時顯著下降，第2周時與對照組無顯著性差異(圖3C)。與對照組相比，實驗組中抑制炎癥發(fā)生的因子IL－10在上述兩個時間點均有顯著上升(圖3D)。

圖2 ADSCs促進創(chuàng)面愈合及在創(chuàng)面周圍的存活

圖3 ADSCs對創(chuàng)面愈合過程中(1、2周)炎癥因子IL－1(A)、IL－6(B)、MCP－1(C)和IL－10(D)表達的影響(*p＜0．01)

討 論

如何獲得足夠數(shù)量的可以應用于治療的干細胞一直是干細胞應用過程面對的難題。胚胎干細胞具有分化為人體各種類型細胞的潛能，但是其應用一直受到倫理學的限制。成體干細胞，尤其是MSCs的應用，受到了廣泛的關(guān)注。MSCs具有自我更新及多向分化潛能，其應用不受倫理學限制。目前研究最為深入的MSCs為骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)，然而BMMSCs需要從骨髓中獲取，其應用也受到一定的限制。2001年Zuk PA和Zhu Min從人抽脂術(shù)中抽取的脂肪組織懸液中第一次分離獲得了具有多向分化潛能的干細胞，能向脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞及肌肉細胞等定向誘導分化［4～6］。脂肪組織中干細胞含量遠遠高于骨髓中的干細胞含量，而且人脂肪組織獲取較為容易，可以從抽脂手術(shù)中獲取大量的脂肪組織。因此，脂肪干細胞可以作為人干細胞庫的重要來源，有非常重要的研究和應用價值。本研究中成功從GFP－C57BL小鼠腹股溝脂肪組織中獲取ADSCs，其具有成脂及成骨多向分化潛能，并能持續(xù)表達GFP蛋白，為體內(nèi)干細胞的示蹤提供很好的條件。

MSCs促進皮膚創(chuàng)面愈合的機制一直受到廣泛的關(guān)注，研究表明MSCs可通過分化為皮膚相關(guān)細胞、促進成纖維細胞的增殖、促進創(chuàng)面血管化［3］等途徑促進皮膚創(chuàng)面的愈合，而另外存在的機制仍需要進一步研究［1～3］。MSCs具有免疫調(diào)節(jié)和炎癥調(diào)節(jié)能力，能夠抑制過度發(fā)生的炎癥，緩解炎癥相關(guān)疾病發(fā)生的程度［7］。有大量的研究表明，胚胎期皮膚愈合是低炎癥環(huán)境下發(fā)生的，愈合速度較成體皮膚快，并且不會有瘢痕的形成［8］;同時，創(chuàng)面炎癥程度的適當減弱以及某些炎性細胞的缺失也能夠促進創(chuàng)面愈合的速度?；谏鲜鲅芯勘尘翱梢酝茰y，MSCs有可能通過緩解創(chuàng)面局部的炎癥反應促進創(chuàng)面的愈合。本研究發(fā)現(xiàn)，在創(chuàng)面術(shù)后1周和兩周，ADSCs可以顯著抑制促炎因子IL－1、IL－6和MCP－1的表達，提示ADSCs緩解了創(chuàng)面局部炎癥的發(fā)生。同時，ADSCs促進了抗炎因子IL－10的表達，提示ADSCs是通過促進體內(nèi)IL－10的表達調(diào)節(jié)炎癥反應的。研究表明，BMMSCs可在炎癥環(huán)境下分泌前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)，后者可促進巨噬細胞分泌IL－10。由此可以推測，ADSCs植入體內(nèi)后，在炎癥環(huán)境誘導下分泌PGE2，PGE2促進體內(nèi)巨噬細胞分泌抗炎因子IL－10，IL－10最終緩解了創(chuàng)面愈合過程中的炎癥反應，進而愈合速度加快。

早期研究一般認為干細胞修復組織再生主要通過分化為組織相關(guān)細胞，參與新生組織的構(gòu)建［1，3］。近年來，越來越多的研究傾向于認為干細胞在移植后存活數(shù)量隨時間急劇下降，極少量的細胞不會通過直接參與新生組織的構(gòu)建促進組織再生，更有可能是通過改變局部微環(huán)境(如炎癥)促進組織再生的。本研究同樣證實了這一觀點。利用本研究中獲取GFPC57BL小鼠來源的ADSCs持續(xù)表達GFP蛋白的特點，進行了細胞在體內(nèi)失蹤及存活情況的研究。結(jié)果表明，在細胞移植后2周，體內(nèi)只有少量ADSCs存活，提示ADSCs可能是通過旁分泌作用緩解創(chuàng)面局部炎癥反應，進而促進創(chuàng)面愈合。

1 Altman AM，Yan Y，Matthias N，et al．Human adipose－derived stem cells seeded on a silk fibroin－chitosan scaffold enhance wound repair in a murine soft tissue injury model［J］．Stem Cells，2009，27(1):250－258

2 Kim WS，Park BS，Sung JH，et al．Wound healing effect of adipose－derived stem cells:a critical role of secretory factors on human dermal fibroblasts［J］．J Dermatol Sci，2007，48(1):15 －24

3 Wu Y，Chen L，Scott PG et al．Mesenchymal stem cells enhance wound healing through differentiation and angiogenesis［J］．Stem Cells，2007，25(10):2648－2659

4 Zuk PA，Zhu M，Ashjian P，et al．Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells［J］．Mol Biol Cell，2002，(12):4279 －4295

5 Ogawa R，Wizuno H，Hyakusoku H．Chondrogenic and osteogenic differentation of adipose－derived stem cells islated from GFP transgenic mice［J］．Nippon Med Sch，2004，71(4):240－241

6 孫雅娟，劉魯川，金巖，等．綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠脂肪間充質(zhì)干細胞的多向分化潛能［J］．第四軍醫(yī)大學學報，2008，29(7):623－625

7 Zhang Q，Shi S，Liu Y，et al．Mesenchymal stem cells derived from human gingiva are capable of immunomodulatory functions and ameliorate inflammation－related tissue destruction in experimental colitis［J］．J Immunol，2009，183(12):7787 －7798

8 吳國強，李耀輝，劉曉艷，等．兔胚胎皮膚傷口無瘢痕愈合機制研究［J］．中國臨床康復，2004，8(26):5574－5575