練 鑫 翁志梁 吳秀玲 陳盛燁 王思齊 李澄棣

腎細胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是最常見的腎實質(zhì)惡性腫瘤，晚期治療缺乏有效手段。Jade－1是一種抗增殖和促凋亡蛋白，廣泛存在腎細胞中的一種泛素連接酶，通過泛素化作用降解蛋白，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的功能［1～3］。Jade－1在腎細胞癌的發(fā)展過程中是一個抑制因素，目前國內(nèi)對其研究未見報道。Wnt信號通路在細胞的分化、增殖和凋亡等生理過程及細胞癌變、腫瘤侵襲等病理過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。β－catenin參與多種致癌信號，在多種人類腫瘤中過表達，是Wnt通路的關鍵信號蛋白［4］。Jade－1介導的Wnt/β－catenin信號通路異常激活是近年提出的一種新的調(diào)節(jié)機制［5，6］。鑒于此，本研究采用免疫組化和熒光定量RT－PCR檢測Jade－1與β－catenin在腎癌組織中的表達情況，分析兩者與臨床病理特征關系，并分析它們表達的相關性，初步探討Jade－1在腎癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用，為闡明腎癌發(fā)生的機制和尋找治療腎癌的方法提供有效依據(jù)。

材料與方法

1．標本:溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院2009～2011年間60例腎癌組織，其中腎透明細胞癌48例，乳頭狀細胞癌7例，嫌色細胞癌5例。男性38例，女性22例，患者年齡28～88歲之間，中位年齡56．0歲。按Fuhrman標準進行腫瘤分級，Ⅰ級31例(51.7%)，Ⅱ級 19例(31.7%)，Ⅲ ～Ⅳ級 10例(16.6%)。另收集同期經(jīng)病理證實的11例遠離腫瘤的正常腎臟組織標本作為對照。

2．主 要 試 劑:多克 隆 抗 體 Jade－1(sigma，Cat:HPA020016，工作濃度 1∶75)，β － catenin 抗體(BOISS，cat:bs－1165R，工作濃度1∶300);免疫組化和DAB顯色試劑盒(北京中杉公司)。Trizol(Invitrogen公司)，RevertAIDTM First Strand CDNA Synthesis Kit(Fermentas公司)，SYBR(R)GREEN PCR Master Mix(美國ABI公司)。

3．免疫組化檢測:采用Envision免疫組化二步法，Image－Pro Plus 6．0軟件選取并分析陽性區(qū)域，計算積分光密度值(MD)來反映陽性蛋白的強度或濃度。

4．結(jié)果判定:Jade－1:(1)400倍視野的5個區(qū)域算染色陽性細胞百分率:≤5%計0分，6% ～25%1分，26% ～50%2分，50% ～75%3分，＞75%4分;(2)染色強度:基本不著色計0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。每張切片的染色細胞百分率得分和染色程度相加:≤3分為陰性(－)，4～5分為弱陽性(+)，6～7分為陽性(++)。陰性和弱陽性為陰性;β－catenin:以細胞質(zhì)陽性細胞＜10%為胞質(zhì)表達陰性，10% ～75%作為胞質(zhì)表達弱陽性(+)，≥75%為胞質(zhì)表達強陽性(++)。

5．熒光定量RT－PCR:(1)引物設計與合成:Primer Express 5．0設計引物，上海基康生物工程有限公司合成(表1)。(2)提取RNA及反轉(zhuǎn)錄反應:總RNA的提取及cDNA的制備根據(jù)Trizol RNA提取試劑盒說明書操作。(3)熒光定量PCR反應:提取組織總RNA經(jīng)分光光度儀，選擇OD值在1．8～2.0之間的RNA產(chǎn)物進行cDNA反轉(zhuǎn)錄。條件優(yōu)化為反應體系 20μL:SYBR(R)GREEN PCR Master Mix 10μl，上下游引物各 0．5μl，引物終濃度為 200nM，cDNA 模板 1μl，雙蒸水補足至20μl。反應條件:50℃ 2 min UNG酶作用消除前次反應產(chǎn)物的污染，95℃ 預變性 5min，95℃ 變性 15s，60℃ 復性延伸1min，40個循環(huán)。所有樣本3次重復測定，每次實驗包含陰性對照，GAPDH內(nèi)參標準化。對 Jade－1、β－catenin、GAPDH基因擴增產(chǎn)物進行熔解曲線分析得到單一熔解峰，擴增效率檢測接近100%。

表1 RT－PCR擴增的mRNA及內(nèi)參的引物序列

結(jié) 果

1．免疫組化結(jié)果。(1)Jade－1和β－catenin蛋白的表達:Jade－1正常腎組織中為胞質(zhì)高表達;在腎癌中低表達甚至缺失(圖1)。β－catenin正常腎小管上皮胞質(zhì)低表達或不表達;在腎癌中胞質(zhì)高表達或蓄積(圖2)。Jade－1陽性表達率為35．0%(21/60)顯著低于正常腎組織100．0%(11/11)(χ2=15.864，P=0．000);β －catenin陽性表達率為 86．7%(52/60)，顯著高于正常腎組織 27．3%(3/11)(χ2=21.089，P=0．000)。在其中48例透明細胞癌中，Jade－1陽性表達率為25．0%(12/48)顯著低于正常腎組織100．0%(11/11)(χ2=21．163，P=0.000)，β － catenin陽性表達率91．7%(44/48)顯著高于正常腎組織27．3%(3/11)(χ2=22．903，P=0.000)。進一步 Image－Pro Plus 6．0軟件對所有采集圖片行光密度分析，每例樣本的測量結(jié)果是該樣本全部圖片的累計視野測量參數(shù)值(平均光密度=IOD SUM/area)的均數(shù)反映陽性蛋白的強度或濃度(圖3)。(2)與臨床病理學指標的關系:Jade－1表達與腫瘤大小、Fuhrman分級和臨床分期密切相關(p＜0.05)，而與年齡、性別和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯相關(P＞0．05);β－catenin與Fuhrman分級和臨床分期密切相關(p＜0．05)，而與年齡、性別、腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯相關(P＞0.05)(表2)。(3)腎癌中Jade－1和β －catenin的相關性:經(jīng)Image－Pro Plus 6．0軟件光密度分析測量標本全部圖片的平均光密度的均數(shù)所測結(jié)果繪制成散點圖，發(fā)現(xiàn)Jade－1和β－catenin的表達伴隨線性變化趨勢，相關分析 r= －0．695，P ＜0．01(圖4)。

表2 Jade－1和β－catenin在腎癌中的表達與臨床病理學指標的關系

圖4 腎透明細胞癌組織中Jade－1和β－catenin平均光密度相關性散點圖

2．熒光定量RT－PCR結(jié)果:(1)Jade－1和βcatenin的mRNA的表達:采用2－△△CT方法分析。由表3所見，腎癌組的Jade－1表達水平下降，為正常組的0．202倍(p＜0．05)，兩組間 β －catenin表達無顯著性差異(P＞0．05)?？傮w而言，在腎癌中，Jade－1表達相對于正常組呈下調(diào)趨勢，而β－catenin在腎癌表達無顯著性差異(圖5)。

表3 Jade－1和β－catenin在透明細胞癌和腎正常組織中的表達差異

圖5 腎癌中，Jade－1表達相對于正常組織呈下調(diào)趨勢，而兩組間β－catenin表達無明顯差異

討 論

研究發(fā)現(xiàn)，Jade－1是腎細胞癌的一個候選抑癌基因［1］。目前對它的研究集中在腎癌細胞生長增殖調(diào)控等方面，研究結(jié)果提示［3］，Jade－1是一種通過與 VHL(Von Hippel－ Lindau)蛋白［7］相互作用而穩(wěn)定富集于腎臟易降解的轉(zhuǎn)錄因子。VHL是一種在腎透明細胞癌的發(fā)生發(fā)展中通過VHL－HIF依賴途徑起重要作用的抑癌基因。但非依賴途徑的研究還不夠系統(tǒng)全面［7］。Jade－1能抑制裸鼠中腎癌細胞生長和腫瘤形成。最近，Chitalia等［3］提出在腎細胞癌中VHL的缺失可以通過降解β－catenin導致腫瘤形成，是Wnt經(jīng)典通路β－catenin的抑制劑和PVHL的重要調(diào)節(jié)者。Jade－1與bTrCP并聯(lián)是β－catenin的E3泛素連接酶。據(jù)此推測Jade－1是E3連接酶的單一配體(而不是bTrCP)。pVHL依賴Jade－1下調(diào)β－catenin從而抑制Wnt通路，這一觀點支持Jade－1和Wnt通路在腎癌發(fā)生過程中所起的作用。Jade－1因為pVHL而抑制Wnt信號代表了一種新的腫瘤抑制途徑。據(jù)此把腎特異性pVHL腫瘤抑制通路和Wnt通路聯(lián)系起來成為一種新的腫瘤發(fā)生通路。

Jade－1通過泛素化β－catenin及利用pVHL調(diào)節(jié)抑制來限制Wnt通路。據(jù)此，我們推測Jade－1和β－catenin可能成為腎細胞癌藥物治療的新靶點。國內(nèi)對Jade－1的研究尚未報道，國外在實體腫瘤中的表達及作用研究也未見報道。

Jade－1在RCC胞質(zhì)中表達缺失。Jade－1是一種抗增殖和促凋亡蛋白［3］。本研究顯示，在腎癌中Jade－1表達陽性的比例顯著低于正常腎組織(35%，p＜0．001)，提示Jade－1在 RCCC中表達降低。平均光密度結(jié)果顯示腎癌組織Jade－1蛋白的MD值與正常組織比較顯著降低(p＜0．05)。單因素分析的結(jié)果顯示，F(xiàn)uhrman分級高是Jade－1低表達的相關因素(OR=4．000，95%CI:1．081 ～ 14．805，P=0.032)。這可能與Jade－1通過泛素化β－catenin和利用p VHL調(diào)節(jié)Wnt通路的抑制來限制Wnt通路有關。Jade－1的表達還與腫瘤大小、Fuhrman分級和臨床分期密切相關(p＜0．05)。

β－catenin在RCC胞質(zhì)中積聚。β－catenin是促增殖和抗凋亡的一種致癌蛋白，其功能是一種連接蛋白，正常情況定位于胞膜內(nèi)側(cè)，信號蛋白作用在正常組織中被抑制［3］。然而在RCC細胞中β－catenin的胞質(zhì)積聚現(xiàn)象十分常見，多項研究表明RCC細胞胞質(zhì)中β－catenin蛋白的水平升高，上下游多種目標基因被激活［8，9］。本文 48 例 RCC 細胞中，44 例(91.7%)胞質(zhì)β－catenin陽性表達，22例(50%)強陽性，與文獻報道相仿。光密度結(jié)果腎癌組織βcatenin蛋白的MD值與正常組織比較顯著升高(p＜0．05)。熒光定量RT－PCR結(jié)果顯示腎癌和正常兩組間β－catenin表達卻無明顯差異。目前對βcatenin在胞質(zhì)中積聚的解釋有多種。臧桐等［9］檢測RCC細胞和正常腎組織中β－catenin的mRNA水平兩者無明顯差異，提出β－catenin的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)異常為其胞質(zhì)積聚的主要原因;β－catenin的磷酸化降解過程中有VHL蛋白參與，而在RCC細胞中VHL蛋白的表達卻存在缺陷，提示β－catenin的胞質(zhì)積聚可能與降解障礙有關［10，11］。Vipul等認為 β －catenin與Jade－1結(jié)合泛素化作用而被降解，從而抑制Wnt/β－catenin致癌信號通路。我們推測，VHL表達缺失引起Jade－1蛋白水平下調(diào)導致β－catenin的表達上調(diào)，蛋白異常蓄積，激活 Wnt/β－catenin致癌信號通路從而參與腎癌的發(fā)生發(fā)展。

RCC中Jade－1與β－catenin表達負相關。Jade－1是一種抗增殖和促凋亡蛋白，β－catenin則是促增殖和抗凋亡的致癌蛋白。Jade－1是Wnt通路βcatenin的抑制劑及PVHL的重要調(diào)節(jié)者。Jade－1通過泛素化β－catenin及利用pVHL調(diào)節(jié)抑制來限制Wnt通路。單和多因素分析結(jié)果均提示Jade－1與β－catenin的胞質(zhì)表達呈負相關，Jade－1可能是Wnt/β－catenin信號通路的組成部分。在RCCC中，表達降低的Jade－1可能還與β－catenin及其下游激活的目標基因一起共同參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

本研究結(jié)果表明Jade－1、β－catenin表達與腎癌組織的病理分級及臨床分期密切相關。Jade－1通過泛素化β－catenin和利用pVHL調(diào)節(jié)Wnt通路的抑制來限制Wnt通路，其機制可能成為腎細胞癌藥物治療的新靶點。

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