俞富祥 季世強(qiáng) 蘇龍豐 張啟瑜

近年來，肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)的活化與增殖是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，已逐漸獲得共識。有較多研究顯示，骨髓間質(zhì)干細(xì)胞可抑制HSCs活化和肝纖維化進(jìn)展［1，2］。但骨髓源性間充質(zhì)干細(xì)胞來源困難、取材不易，使其應(yīng)用前景受限。而脂肪間質(zhì)干細(xì)胞(adipose tissue－derived mesenchymal stem cells，ADSCs)與骨髓間質(zhì)干細(xì)胞相比較而言，不僅來源豐富，取材容易，而且具有自我更新、多向分化和高增殖特性等重要干細(xì)胞特征，與骨髓間質(zhì)干細(xì)胞相類似［3，4］。本研究主要探討 ADSCs在細(xì)胞水平對大鼠肝纖維化的影響。

材料與方法

1．材料及試劑:健康6周齡 SD大鼠10只，體重150～200g，供分離ADSCs及HSCs，由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供;L－DMEM培養(yǎng)基，購自Hyclone公司;小牛血清購自Gibco公司;Ⅳ型膠原酶、DNaseⅠ購自Sigma公司;Optiprep分離液購自AXISSHIELD 公司;孔徑 0．4μm Transwell insert半透膜及6孔塑料培養(yǎng)板購自Millipore公司;鼠抗平滑肌肌動蛋白(α－SMA)單克隆抗體、標(biāo)記FITC的山羊抗鼠抗體購自Southern－Biotech公司;Hoechst33342購自 Sigma公司，AEC試劑盒購自博士德生物公司。

2．細(xì)胞分離及培養(yǎng):(1)脂肪間質(zhì)干細(xì)胞(adipose tissuederived mesenchymal stem cells，ADSCs)的分離、培養(yǎng):在無菌條件下，從健康SD大鼠腹腔內(nèi)獲取脂肪組織1～2mg，充分剪碎后加入分離液2ml(含1mg/ml膠原酶)消化，37℃振蕩搖晃1h，然后以200×g離心5min，沉積的細(xì)胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液制成均勻的細(xì)胞懸液，均勻接種于培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)至皿底80%時傳代，每2～3天換液1次。采用第3～5代ADSCs，用免疫熒光染色方法檢測ADSCs相對特異細(xì)胞表面標(biāo)志CD73、CD90及CD45。(2)大鼠正常肝細(xì)胞系(buffalo rat liver cells，BRLs)的培養(yǎng):BRLs由溫州醫(yī)學(xué)院龍灣實(shí)驗(yàn)中心贈與，復(fù)蘇后接種于培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)液為含10%小牛血清的L－DMEM，每2～3天換液1次。(3)HSCs分離與培養(yǎng):按實(shí)驗(yàn)室前期建立的方法進(jìn)行分離HSCs。用含10%小牛血清的L－DMEM培養(yǎng)基接種于塑料培養(yǎng)瓶。常規(guī)培養(yǎng)48h后換液，5～7天后HSCs活化，增殖迅速。根據(jù)細(xì)胞生長情況每2～3天換液1次。

3．細(xì)胞共培養(yǎng)方法的建立:根據(jù)孔徑0．4μm的transwell insert半透膜僅可以通過培養(yǎng)液而不能透過細(xì)胞的特點(diǎn)，在6孔塑料培養(yǎng)板上架起transwell insert半透膜，建立雙層細(xì)胞共用培養(yǎng)液而不直接接觸的培養(yǎng)體系。每孔培養(yǎng)體系上層接種ADSCs 2×104cells/well，培養(yǎng)體系下層接種原代及第3代的HSCs 2×104cells/well。另設(shè) BRLs代替 ADSCs作為陰性對照，單純培養(yǎng)的 HSCs為空白對照。各組均采用37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含10%小牛血清L－DMEM。培養(yǎng)72h后，倒置相差顯微鏡下動態(tài)觀察活體細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。

4．ADSCs對HSCs活化的影響:本實(shí)驗(yàn)通過Western blotting法檢測HSCsα－肌動蛋白(α－SMA)的表達(dá)，確定HSCs的活化狀態(tài)。按前述方法在共培養(yǎng)72h后，在各培養(yǎng)體系HSCs中分別加入現(xiàn)配的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30min，于4℃12000r/min離心15min，取上清進(jìn)行蛋白定量。取一定量蛋白樣品上樣。SDS－PAGE膠電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉緩沖液室溫?fù)u床振蕩1h，加入一抗體 α －SMA(1∶100)，4℃過夜，TBST 漂洗 3 次，10 分鐘/次，孵育二抗(1∶30000)，37℃ 恒溫振搖1h;TBST漂洗3次，10分鐘/次，化學(xué)發(fā)光，顯影、定影，對膠片圖像掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)Gel－Pro analyzer分析目標(biāo)帶的灰值。

5．CCK－8比色法檢測ADSCs對HSCs增殖的影響:按前述方法在共培養(yǎng)72h后，每孔加入CCK－8溶液80μl，繼續(xù)培養(yǎng)2h，用自動酶標(biāo)儀于450nm處檢測每孔的吸光度(A)值，間接計(jì)算細(xì)胞增殖程度。

6．流式細(xì)胞儀檢測ADSCs對HSCs凋亡的影響:按前述方法在共培養(yǎng)72h后，用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，每個樣本收集約2×105個細(xì)胞，1500r/min離心5min后，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞2次，1500r/min離心5min，加入200μl Binding Buffer重懸細(xì)胞;加入5μl Annexin V－FITC混勻后，再加入5μl Propidium Iodide，混勻;室溫、避光反應(yīng)20min后上機(jī)檢測，流式細(xì)胞儀激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長530nm。

7．細(xì)胞培養(yǎng)液細(xì)胞因子的測定:為探究ADSCs如何能促使HSCs發(fā)生細(xì)胞凋亡，并抑制HSCs活化，從而發(fā)揮抗肝纖維化的作用，我們推測ADSCs可能通過分泌細(xì)胞因子，從而間接影響HSCs。我們將ADSCs及BRLs分別單獨(dú)培養(yǎng)于6孔塑料培養(yǎng)板，每孔培養(yǎng)細(xì)胞2×105個，培養(yǎng)72h后，分別取培養(yǎng)液，使用各種細(xì)胞因子(如肝細(xì)胞生長因子HGF、轉(zhuǎn)化生長因子TGF、及神經(jīng)生長因子NGF等)ELISA試劑盒，按照試劑盒指示說明，檢測其中的細(xì)胞因子含量。

結(jié) 果

1．HSCs的分離、培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)特點(diǎn):每只大鼠HSCs的獲得率約為(1～2)×107，臺盼藍(lán)染色細(xì)胞存活力＞95%。相差顯微鏡下，剛分離出來的HSCs呈圓球形，胞質(zhì)內(nèi)含較多脂肪小滴，熒光顯微鏡在328nm波長的激發(fā)光下，可觀察到藍(lán)綠色熒光。培養(yǎng)2～3天后，細(xì)胞貼壁;5～7天后，細(xì)胞伸展呈星形。見圖1。

圖1 鼠原代HSCs

2．ADSCs的分離、培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)特點(diǎn):取大鼠腹股溝處脂肪組織1～2mg，可以分離消化出(1～2)×106個ADSCs。經(jīng)臺盼藍(lán)染色可確定細(xì)胞的存活率95%以上。培養(yǎng)4～6h后即可見部分細(xì)胞貼壁，呈短棒形。48h后可見細(xì)胞呈梭形生長。5～6天后細(xì)胞生長迅速，當(dāng)細(xì)胞生長至80%匯合時，即可傳代培養(yǎng)(圖2)。

3．ADSCs抑制 HSCsα －SMA的表達(dá):共培養(yǎng)72h，免疫細(xì)胞化學(xué)染色測定α－SMA在HSCs中表達(dá)情況，可見陽性染色的α－SMA位于胞質(zhì)內(nèi)，呈高張力纖維狀分布，ADSCs+HSCs組HSCs胞質(zhì)內(nèi)α－SMA表達(dá)較BRLs+HSCs組明顯降低，結(jié)果見圖3。通過Western blotting法檢測α－的表達(dá)，與BRLs+HSCs組比較，發(fā)現(xiàn) ADSCs+HSCs組 HSCsα－SMA表達(dá)水平明顯下降，結(jié)果見圖4。

4．ADSCs抑制 HSCs的增殖:本實(shí)驗(yàn)以單獨(dú)HSCs培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)作為參照值，利用吸光度值間接推算細(xì)胞增殖程度。與BRLs對照組相比，HSCs與ADSCs共培養(yǎng)72h，HSCs增殖活性受抑制明顯(p＜0．05)，見圖5。光學(xué)顯微鏡下，HSCs的細(xì)胞形態(tài)無顯著變化，培養(yǎng)體系中相應(yīng)的ADSCs及BRLs的生長狀態(tài)良好。

圖5 各培養(yǎng)體系中HSCs的細(xì)胞增殖程度比較

5．HSCs的凋亡情況:HSCs凋亡率流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，ADSCs+HSCs組的HSCs凋亡率最高，與BRLs+HSCs組、單獨(dú)HSCs組相比差異有顯著性意義(P ＜0．05)，見圖6、圖7。

圖6 HSCs的凋亡情況

圖7 各培養(yǎng)體系中HSCs的細(xì)胞凋亡程度比較

6．細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞因子濃度的測定(pg/ml):通過測定細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞因子含量發(fā)現(xiàn)ADSCs分泌的細(xì)胞因子中，與肝細(xì)胞比較，HGF量較多(p＜0.05)，而TGF分泌量明顯較少(p＜0．01)，而 NGF兩者之間無顯著差別(P＞0．05)，見表1。

表1 兩種細(xì)胞培養(yǎng)液中各細(xì)胞因子含量比較

討 論

HSCs屬于肝臟的間質(zhì)細(xì)胞，它在肝纖維化過程中扮演著重要的角色，現(xiàn)已成共識［1，2，5～7］。在病理?xiàng)l件下如肝臟受到物理、化學(xué)及病毒感染生物因素的刺激時，HSCs增殖并激活，激活的HSCs通過增生和分泌細(xì)胞外基質(zhì)，對肝纖維化的形成起著至關(guān)重要作用。

國內(nèi)外已有研究顯示，骨髓間質(zhì)干細(xì)胞通過抑制HSCs的活化而達(dá)到緩解肝纖維化進(jìn)展［5～7］。但骨髓干細(xì)胞獲取創(chuàng)傷大，且數(shù)量少，影響其在臨床及研究領(lǐng)域的進(jìn)一步廣泛應(yīng)用。自Zuk PA等于2001年首次報(bào)道從人脂肪組織中分離出ADSCs以來，已有較多研究先后證實(shí)了這些細(xì)胞在合適誘導(dǎo)劑的作用下可向成骨、軟骨、脂肪和成肌等細(xì)胞分化，表現(xiàn)出與骨髓間質(zhì)干細(xì)胞相類似的高增殖活性與多向分化潛能等干細(xì)胞特性［3，4，8］。而 ADSCs與骨髓干細(xì)胞比較而言，因其數(shù)量多、獲取方便等優(yōu)勢，成為干細(xì)胞移植治療慢性肝病又一頗具發(fā)展前景的待選細(xì)胞，為當(dāng)前組織工程種子細(xì)胞研究的重點(diǎn)。

既往干細(xì)胞移植治療肝硬化，多集中于研究探討干細(xì)胞在肝內(nèi)生長分化為肝細(xì)胞，從而達(dá)到改善肝功能的作用。有實(shí)驗(yàn)顯示，HSCs的活化與增殖是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)［9］。那么ADSCs是否可通過調(diào)控HSCs的增殖與活化發(fā)揮對肝纖維化的抑制作用?為探討ADSCs是否能夠抑制HSCs活化與增殖，我們利用孔徑0．4μm的transwell僅透過培養(yǎng)液而不能通過細(xì)胞的特點(diǎn)，建立ADSCs與HSCs非直接接觸的共培養(yǎng)體系，初步的結(jié)果顯示HSCs的活化、增殖較BRLs等共培養(yǎng)體系明顯抑制，表明ADSCs可以通過非直接接觸抑制HSCs活化與增殖。

越來越多的研究顯示，通過誘導(dǎo)活化態(tài)HSCs凋亡，進(jìn)而減少細(xì)胞外基質(zhì)分泌，是治愈肝纖維化的關(guān)鍵［10］。動物肝纖維化模型自發(fā)逆轉(zhuǎn)的研究顯示，誘導(dǎo)活化態(tài)HSCs的凋亡是肝纖維化得以逆轉(zhuǎn)的關(guān)鍵［11，12］。我們通過此共培養(yǎng)體系，發(fā)現(xiàn) ADSCs不僅能抑制HSCs活化與增殖，而且還可以促進(jìn)HSCs凋亡，最終使活化態(tài) HSCs數(shù)量減少，從而有效減弱HSCs在肝纖維化過程中的作用。

對于干細(xì)胞如何起到抗肝纖維化作用，其機(jī)制至今尚未明確。有文獻(xiàn)認(rèn)為是多因素作用，主要包括兩方面:一是通過干細(xì)胞分化為功能性肝細(xì)胞，促進(jìn)肝再生;二是干細(xì)胞通過直接抑制其增殖激活并誘導(dǎo)HSCs凋亡，同時分泌抗纖維化物質(zhì)如HGF、NGF等。有文獻(xiàn)報(bào)道，HGF及NGF均有促進(jìn)HSCs凋亡的作用，同時具有誘使ADSCs向肝細(xì)胞分化的功能，還抑制TGF－β1的產(chǎn)生，阻止肝臟發(fā)生纖維化，并具有抗肝細(xì)胞凋亡的活性。我們通過測定細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞因子含量也發(fā)現(xiàn)ADSCs與對照組肝細(xì)胞比較，可分泌較多量HGF、較少量分泌TGF(p＜0.05)。因此，根據(jù)本研究結(jié)果，我們推測ADSCs可能通過分泌多種細(xì)胞因子聯(lián)合抑制HSCs的增殖與活化，促使HSCs凋亡，從而在治療肝纖維化中發(fā)揮作用。

總之，根據(jù)目前初步研究成果顯示，ADSCs可抑制HSCs活化、增殖，促進(jìn)凋亡。但對ADSCs研究起步時間相對較晚，因而研究深度不及其他類型的間質(zhì)干細(xì)胞，諸如ADSCs活體移植問題，干細(xì)胞移植的致瘤性問題及異體ADSCs的移植排斥等問題均有待進(jìn)一步深入研究。

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