廖書生 阮琴韻 林美燕 鄢 磊 蘇津自 林茂海
心肌梗死后功能心肌細(xì)胞的丟失和瘢痕組織形成最終導(dǎo)致心功能不全。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)移植技術(shù)可使干細(xì)胞在瘢痕組織內(nèi)分化為有功能的心肌細(xì)胞,從而可能改善心臟收縮功能。精確評價局部心肌功能的改善是心肌梗死模型MSCs移植研究的關(guān)鍵之一。源于斑點追蹤技術(shù)的二維應(yīng)變超聲心動圖(2-dimensional strain echocardiography,2DSE)使局部心肌功能的精確評價成為可能[1,2]。本研究應(yīng)用2DSE觀察 MSCs移植后局部心肌功能的變化,旨在探討該技術(shù)在大鼠心肌梗死模型MSCs移植研究中的應(yīng)用價值。
1.實驗動物及分組:選用40只雄性SD大鼠,8~10周齡,體質(zhì)量250~300g。采用隨機(jī)分組方法分為心肌梗死組14只、MSCs治療組16只、空白對照組10只。心肌梗死組和MSCs治療組建立心肌梗死模型,對照組只進(jìn)行假手術(shù)。
2.超聲儀器:采用GE VIVID7 Dimension彩色多普勒超聲診斷儀,配備10S探頭(頻率5.4~11.8MHz)、二維應(yīng)變分析軟件(EchoPAC 7.0)。
3.MSCs的分離、純化、培養(yǎng)、鑒定及DAPI標(biāo)記:取SD大鼠股骨和脛骨,用DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔獲取骨髓干細(xì)胞,利用Percoll密度梯度離心法分離純化 MSCs,懸浮于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液內(nèi),置于37℃、含5%的CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng),細(xì)胞長滿時用0.05%的胰酶消化后傳代。采用流式細(xì)胞儀對MSCs細(xì)胞進(jìn)行鑒定。取3~5代傳代的MSCs,DAPI標(biāo)記后備移值。
4.動物模型建立:采用改良的 Pfeffer[3]方法結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支制作心肌梗死模型,以結(jié)扎后左室前壁顏色變白和心電圖相應(yīng)導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)ST段抬高作為判斷模型成功的標(biāo)準(zhǔn)。MSCs治療組于心肌梗死模型構(gòu)建后15 min,在缺血部位心肌直接注射DAPI標(biāo)記好的傳代MSCs(100微升/只);心肌梗死組和空白對照組在相應(yīng)部位只注射無胎牛血清DMEM培養(yǎng)基(100微升/只)。
5.超聲心動圖檢查:分別于術(shù)前1天、術(shù)后1周和術(shù)后4周進(jìn)行超聲心動圖檢查,采用GE VIVID7 Dimension彩色多普勒超聲診斷儀,選用10S高頻探頭,經(jīng)胸獲取大鼠左室乳頭肌水平短軸切面,連續(xù)記錄3個完整心動周期的二維動態(tài)圖像并存入機(jī)載的硬盤,深度為2~3cm,幀頻>200幀/秒。于左室乳頭肌水平短軸切面測量左心室舒張末期和收縮末期內(nèi)徑(LVIDd、LVIDs),計算舒張末期和收縮末期左心室容積(LVEDV、LVESV)、左心室短軸縮短率(FS),應(yīng)用Teichholtz公式計算左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。將存儲的圖像導(dǎo)入EchoPAC 7.0工作站進(jìn)行分析,采用ASE推薦的16節(jié)段法,獲取左心室短軸乳頭肌水平前壁的收縮期峰值徑向應(yīng)變和應(yīng)變率(SR、SrR)、周向應(yīng)變和應(yīng)變率(SC、SrC)。
6.心導(dǎo)管整體心功能指標(biāo)測定:各組大鼠在術(shù)后4周超聲檢查后24h內(nèi)行心導(dǎo)管檢查,實時記錄心電圖和壓力圖,測量以下參數(shù):主動脈收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP),左心室收縮末壓(LVSP)和舒張末壓(LVEDP),左心室壓力最大上升和下降速率(±dp/dtmax),心率(HR)。
7.組織病理學(xué)檢查與免疫組化檢測:移植后4周,超聲及心導(dǎo)管檢查后取出心臟標(biāo)本,在原梗塞部位切取心肌組織,一部分標(biāo)本行冷凍切片(厚約3~5μm),用熒光顯微鏡觀察移植的DAPI標(biāo)記的細(xì)胞分布;另一部分標(biāo)本做石蠟切片,行免疫組織化學(xué)染色。
8.統(tǒng)計學(xué)方法:采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)用配對t檢驗,多組均數(shù)比較采用方差分析,p<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
1.MSCs的培養(yǎng)、鑒定及DAPI標(biāo)記結(jié)果:經(jīng)過培養(yǎng)的MSCs貼壁生長,傳代3代后細(xì)胞呈均一的長梭形,呈放射狀或柵欄樣生長。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞均一性好、純度高,其中 CD31、CD34、CD45表達(dá)陰性,而CD29、CD90表達(dá)陽性。MSCs細(xì)胞DAPI標(biāo)記24h后,用熒光顯微鏡觀察MSCs的胞核發(fā)出明亮藍(lán)色熒光。
2.超聲心動圖結(jié)果:(1)常規(guī)超聲心動圖指標(biāo):與術(shù)前24h相比,術(shù)后1周、術(shù)后4周心肌梗死組和MSCs治療組左心室明顯增大(P <0.05),LVEF、FS顯著降低(p<0.05);術(shù)后4周,MSCs治療組LVEF、FS較心肌梗死組略高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表1)。(2)二維應(yīng)變超聲心動圖:與術(shù)前24h相比,術(shù)后1周、術(shù)后4周心肌梗死組和MSCs治療組左心室前壁2DSE應(yīng)變及應(yīng)變率指標(biāo)(SR、SrR、SC、SrC)均顯著性降低(P <0.05);術(shù)后4周,MSCs治療組的徑向應(yīng)變與應(yīng)變率(SR、SrR)較術(shù)后1周增高,且高于心肌梗死組術(shù)后4周相應(yīng)指標(biāo),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05);但術(shù)后4周心肌梗死組和MSCs治療組的周向應(yīng)變與應(yīng)變率(SC、SrC)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。對照組2DSE各指標(biāo)術(shù)后1周、術(shù)后4周與術(shù)前24h均無顯著性差異(表2、圖1)。
表1 大鼠常規(guī)超聲心動圖指標(biāo)
表1 大鼠常規(guī)超聲心動圖指標(biāo)
與術(shù)前24h相比,*p<0.05;LVEDV.左心室舒張末期容積;LVESV.左心室收縮末期容積;LVEF.左心室射血分?jǐn)?shù);FS.左心室短軸縮短率
組別 指標(biāo) 術(shù)前24h 術(shù)后1周 術(shù)后4周心肌梗死組LVEDV(ml)0.70 ±0.11 0.91 ±0.20*1.39 ±0.16*43.21 ±3.74 40.23 ±4.82 39.67 ±5.38(n=14)LVESV(ml)0.15 ±0.03 0.40 ±0.08*0.67 ±0.15*LVEF(%) 80.25 ±5.41 56.42 ±5.61*53.64 ±8.01*FS(%) 42.65 ±3.42 25.48 ±3.34*24.12 ±4.26*治療組 LVEDV(ml)0.71 ±0.08 0.89 ±0.21*1.31 ±0.16*(n=16)LVESV(ml)0.16 ±0.03 0.38 ±0.12*0.62 ±0.11*LVEF(%) 81.47 ±5.69 55.41 ±6.03*59.72 ±7.24*FS(%) 41.97 ±3.58 25.39 ±4.52*28.03 ±4.29*對照組 LVEDV(ml)0.72 ±0.08 0.71 ±0.11 0.73 ±0.10(n=10)LVESV(ml)0.16 ±0.04 0.18 ±0.05 0.19 ±0.05 LVEF(%) 79.62 ±6.78 80.02 ±7.85 78.92 ±6.35 FS(%)
表2 3組大鼠不同階段左心室前壁2DSE指標(biāo)
表2 3組大鼠不同階段左心室前壁2DSE指標(biāo)
術(shù)后1周、術(shù)后4周與術(shù)前相比,*p<0.05;術(shù)后4周與術(shù)后1周相比,△p<0.05;SR.收縮期峰值徑向應(yīng)變;SC.收縮期峰值周向應(yīng)變;SrR.收縮期峰值徑向應(yīng)變率;SrC.收縮期峰值周向應(yīng)變率
組別 指標(biāo) 術(shù)前24h 術(shù)后1周 術(shù)后4周心肌梗死組 SR(%) 32.48 ±9.99 14.27 ±4.68* 13.81 ±9.36*3.78 ±0.70 3.89 ±0.63 3.82 ±0.88(n=14) SC(%) -13.15 ±1.94 -6.89 ±2.25* -7.05 ±2.55*SrR(s-1) 6.42 ±1.34 3.11 ±0.98* 2.90 ±0.47*SrC(s-1) 4.52 ±1.03 2.76 ±0.78* 2.21 ±0.76*治療組 SR(%) 32.80 ±10.51 11.17 ±2.01* 19.15 ±4.13*△(n=16) SC(%) -11.55 ±3.58 -8.51 ±1.03* -7.66 ±1.73*SrR(s-1) 6.61 ±1.62 2.25 ±0.59* 4.32 ±0.71*△SrC(s-1) 4.55 ±0.81 2.03 ±0.56* 2.87 ±0.81*對照組 SR(%) 35.67 ±5.29 33.23 ±4.68 31.13 ±4.36(n=10) SC(%) -13.37 ±3.89 -11.25 ±3.11 -10.97 ±1.96 SrR(s-1) 6.53 ±1.34 5.74 ±0.98 5.71 ±0.62 SrC(s-1)
圖1 MSCs治療組術(shù)前、術(shù)后1周和術(shù)后4周的典型2DSE曲線A、B,C、D和E、F分別為術(shù)前、術(shù)后1周、術(shù)后4周的2DSE徑向應(yīng)變、徑向應(yīng)變率曲線;B、E顯示術(shù)后1周徑向應(yīng)變和應(yīng)變率較術(shù)前顯著降低;C、F顯示術(shù)后4周徑向應(yīng)變和應(yīng)變率較術(shù)后1周增高
3.心導(dǎo)管左心功能測定結(jié)果:各組心率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與對照組比較,治療組和心肌梗死組的左心室血流動力學(xué)指標(biāo)LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax均顯著降低(P均 <0.05),LVEDP顯著增高(p<0.05);與心肌梗死組相比,治療組LVSP、+dp/dtmax顯著增高(P均<0.05),而LVEDP顯著降低(p<0.05)(表3)。
表3 各組的左心室血流動力學(xué)指標(biāo)比較
表3 各組的左心室血流動力學(xué)指標(biāo)比較
心肌梗死組、治療組與對照組相比,#p<0.05;治療組與心肌梗死組相比,#p<0.05;LVSP:左心室收縮末壓;LVEDP:左心室舒張末壓;+dp/dtmax:左心室壓力最大上升速率;-dp/dtmax:左心室壓力最大下降速率
組別 n LVSP(mmHg) LVEDP(mmHg) +dp/dtmax(mmHg/s) -dp/dtmax(mmHg/s) HR(次/分)心肌梗死組 14 72.37 ±1.06# 28.35 ±3.51# 1732.57 ±192.35# -1571.08 ±252.82#1956.58 ±163.24 463 ±25 433±16治療組 16 83.43 ±8.26#* 22.54 ±3.34#* 2113.86 ±246.44#* -1688.32 ±208.09# 451 ±14對照組 10 112.34 ±10.23 15.67±2.38 2587.29±178.39 -
4.組織學(xué)結(jié)果:移植4周后,MSCs治療組心肌組織切片顯示心肌梗死區(qū)可見DAPI標(biāo)記陽性的細(xì)胞,呈島狀或散在分布,心肌梗死組和空白對照組無DAPI標(biāo)記陽性的細(xì)胞。治療組DAPI核染色陽性的部分移植細(xì)胞可見肌鈣蛋白(Tn-I)表達(dá)陽性(圖2)。
圖2 MSCs治療組大鼠心肌組織學(xué)檢查(×200)
關(guān)于干細(xì)胞移植后心功能改善的確切機(jī)制目前還不清楚。一些學(xué)者認(rèn)為,心肌梗死后心肌組織的微環(huán)境可以誘導(dǎo)干細(xì)胞的遷移和分化,周圍心肌微環(huán)境可提供干細(xì)胞特定分化所需的成心肌生長因子,促使干細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞,即所謂的“環(huán)境誘導(dǎo)分化”理論[4]。本研究發(fā)現(xiàn),注射 MSCs后心肌梗死區(qū)有DAPI標(biāo)記陽性的MSCs歸巢,并且向心肌樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化(DAPI標(biāo)記陽性的移植細(xì)胞有肌鈣蛋白表達(dá))。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為[5,6],在各種因子趨化下 MSCs歸巢至梗死心肌周邊,分化為心肌樣細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞,心肌樣細(xì)胞具有肌纖維的收縮性,與宿主心肌細(xì)胞形成偶聯(lián)而同步收縮,增強(qiáng)了心肌的收縮力,同時新生血管增加了梗死局部血流,從而達(dá)到改善心臟功能。心導(dǎo)管檢測結(jié)果也顯示,MSCs治療組的血流動力學(xué)各指標(biāo)比心肌梗死組明顯改善,包括左心室收縮壓、最大上升速率的升高和舒張末壓明顯降低,表明MSCs移植可以改善左心室整體收縮功能。近期研究[7]證實MSCs在體內(nèi)特定微環(huán)境下可分化為心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞并能有效改善心功能,Berry等[8]人也發(fā)現(xiàn)將MSCs移植到大鼠梗死心肌可以改善心肌重塑、增強(qiáng)心肌收縮。
超聲心動圖是無創(chuàng)監(jiān)測MSCs移植后心功能變化的主要手段之一,既往著重于左心室整體功能(如LVEF)的評價[9]。但局部心肌功能可能比整體心室功能更直接地反映MSCs移植后心肌功能的改善,2DSE技術(shù)的問世使小動物模型局部心肌功能的評價成為可能[10,11]。本研究結(jié)果表明,術(shù)后1周心肌梗死組和MSCs治療組左心室前壁2DSE的應(yīng)變及應(yīng)變率指標(biāo)均較術(shù)前顯著性降低,但兩組間各指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這可能是MSCs在移植1周后尚未分化為有功能的心肌細(xì)胞,Toma等[12]研究也表明MSCs移植1周之后部分移植細(xì)胞才開始出現(xiàn)與宿主心肌相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)。術(shù)后4周,MSCs治療組左心室前壁峰值徑向應(yīng)變和應(yīng)變率(SR、SrR)較術(shù)后1周增高,且高于心肌梗死組術(shù)后4周相應(yīng)指標(biāo),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05),說明MSCs移植治療4周后大鼠局部心肌收縮功能有所改善。但是,本研究模型中MSCs治療組的周向應(yīng)變指標(biāo)(SC、SrC)在術(shù)后4周并見明顯改善,這可能與本研究所觀察的時間不夠長以及樣本量不足有關(guān)。新分化的心肌細(xì)胞在4周內(nèi)尚未使局部心肌纖維層重塑,不足以使心肌在各種方向上的收縮功能(包括周向收縮功能)都得到改善。這些都有待于進(jìn)一步的研究來證實。
本研究結(jié)果顯示,MSCs移植4周后整體心功能指標(biāo)LVEF、FS較心肌梗死組略高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這與以往的研究結(jié)果有所不同,這和本研究觀察時間較短,移植的干細(xì)胞對整體心功能的改善較輕微有關(guān);另一方面,由于大鼠心尖四腔心、二腔心切面的獲取困難而無法使用Simpson's雙平面法計算LVEF值,在一定程度上影響測值的準(zhǔn)確性。因此,對于大鼠心肌梗死模型的研究,應(yīng)用2DSE觀察局部心肌功能的變化來判斷干細(xì)胞移植治療的療效比LVEF等指標(biāo)更合適、可靠。Hartmann等人研究也表明,2DSE在評價大鼠抗腫瘤治療后心肌功能變化方面比傳統(tǒng)超聲心動圖指標(biāo)有更好的敏感性,能更早地發(fā)現(xiàn)局部心肌功能的變化。
由于無法獲取滿意的大鼠心尖四腔心切面,本研究未能了解MSCs移植后心肌梗死大鼠心肌縱向收縮功能變化情況。另外,由于觀察的時間較短,對MSCs移植遠(yuǎn)期療效尚不得而知。
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