木海琦 楊 森 王怡君 陳映鶴

血管生成即在原先存在的血管基礎(chǔ)上血管內(nèi)皮細(xì)胞生殖、遷移并重塑形成新的成熟血管［1］。血管生成在惡性腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中扮演著重要的角色，通過抑制腫瘤血管生長可抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，從而改善病人預(yù)后［2］。在循環(huán)外周血中存在的干細(xì)胞－內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)具有自我增殖和定向歸巢的特性，還可定向分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而在新生血管生成中發(fā)揮了重要作用。一種從中東國家的黑種草籽油中分離出來的主要有效單體－百里醌，近年來證實其具有強大的抑瘤效應(yīng)，同時百里醌可抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)介導(dǎo)的血管生長［3］。但百里醌對EPCs增殖及功能的影響卻未曾報道。因此，本研究將探討百里醌對EPCs生長及功能的影響，并探討其可能機制。

材料與方法

1．主要藥品和試劑:百里醌購自美國Sigma公司;胎牛血清(FBS)和含EDTA胰酶購自美國Gibco公司;EGM－2培養(yǎng)基購自瑞士LONZA公司;人工重組基膜(matrigel)購自美國BD公司;一抗小鼠抗血管內(nèi)皮生長因子受體－2(VEGFR－2)單克隆抗體、兔抗Ⅷ因子多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司;人纖連蛋白(human fibronectin，HFN)購自加拿大Chemicon公司;DiI－ac－LDL購自美國Molecular probe公司;ABC免疫組化檢測試劑盒和AEC染色試劑盒購自華美生物工程公司;MMP－2、MMP－9和β－actin抗體購自美國Epitomics公司。百里醌用無水乙醇配制成10mmol/L，－20℃冰箱保存，用時用不含血清的EGM－2培養(yǎng)基稀釋成所需濃度。

2．EPCs的分離和培養(yǎng):收集2010年9～12月棄用的健康新生兒臍帶血液5例(溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院產(chǎn)科)，每次采集臍血量約30ml。采用密度梯度離心法收集臍血中的單個核細(xì)胞接種在包被有HFN 10cm2培養(yǎng)皿中。加入3ml含10%胎牛血清的EGM－2培養(yǎng)液，24h后更換全部培養(yǎng)液。此后7天內(nèi)每天更換一半培養(yǎng)液，7天后每3天更換全部培養(yǎng)液，同時觀察細(xì)胞生長情況。等待原代細(xì)胞生長匯合后傳代進(jìn)行下一步實驗。

3．DiI－ac－LDL吞噬試驗:取第2代細(xì)胞，吸去原培養(yǎng)基后經(jīng)PBS洗滌3次后，DiI－ac－LDL以4mg/L的終濃度加入培養(yǎng)液，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4h，吸去培養(yǎng)基，用PBS再洗滌3次，2%多聚甲醛固定細(xì)胞20min后，在熒光顯微鏡(OLYMPUS，BX51TF)下觀察細(xì)胞熒光。吞噬DiI－ac－LDL的培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)紅色熒光。用不加 DiI－ac－LDL的同批培養(yǎng)細(xì)胞作空白對照組。陰性對照組為胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC－1。

4．VEGFR－2、Ⅷ因子及CD34免疫組化:取第2代細(xì)胞接種至24孔板中，培養(yǎng)至貼壁。經(jīng)多聚甲醛固定20min，0.3%H2O2－甲醇液封閉內(nèi)源性過氧化物酶10min，PBS浸洗后分別加1∶100稀釋的VEGFR－2、Ⅷ因子及CD34抗體于4℃下孵育過夜。二抗結(jié)合參照ABC免疫組化檢測試劑盒說明書進(jìn)行，之后用AEC染色試劑染色，蘇木素復(fù)染，在倒置相差顯微鏡下(Nikon，TS100)觀察染色結(jié)果。陰性對照組為胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC－1。

5．CCK－8法檢測細(xì)胞增殖:收集處于對數(shù)生長期的EPCs細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，以每孔5×103個細(xì)胞接種到96孔板，過夜待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度百里醌(10、20、40和80nmol/L)作用12h，同時設(shè)置空白調(diào)零組(不加細(xì)胞加入等量的PBS)，以及陰性對照組(加入等量的溶媒)。藥物作用結(jié)束前1h，各孔加入0．01ml CCK－8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1h，酶標(biāo)儀測A450值，實驗重復(fù)3次。細(xì)胞存活率=(實驗組A450值－空白調(diào)零組A450值)/(對照組A450值－空白調(diào)零組A450值)×100%

6．侵襲實驗:在24孔Transwell小室(Corning公司，美國)濾膜上方涂敷人工基膜(Matrigel)50μl，放置于37℃培養(yǎng)箱孵育5h，使其形成凝膠狀。計數(shù)2×104個細(xì)胞加入100μl不含血清的EGM－2培養(yǎng)基中至入上室，分別加入不同濃度百里醌(10、20、40和80nmol/L)，以溶媒作為對照組。下層培養(yǎng)孔加500μl含20%胎牛血清的EGM－2培養(yǎng)基，每組設(shè)5個復(fù)孔。培養(yǎng)12 h后取出濾膜，小心用棉球棒擦掉小室內(nèi)表面未穿過膜的細(xì)胞，甲醛固定后結(jié)晶紫染色，至倒置顯微鏡下計數(shù)膜背面的細(xì)胞數(shù)，隨機計數(shù)5個視野，計算平均值。每組重復(fù)3次。

7．小管形成實驗:4℃下于96孔板中每孔加入100μl Matrigel，鋪平后置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)固定5h。以每孔4×104細(xì)胞接種于培養(yǎng)板，加入不同濃度百里醌(10、20、40和80nmol/L)，以溶媒為對照組，每組設(shè)5個復(fù)孔。37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h后，倒置顯微鏡下觀察并拍照，計數(shù)不同濃度百里醌作用后EPCs小管生成數(shù)。

8．Western blotting檢測 EPCs中 MMP－2和 MMP－9的表達(dá):收集處于對數(shù)生長期的EPCs細(xì)胞，不同濃度百里醌(10nmol/L、20nmol/L)作用EPCs細(xì)胞12h后，RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取上清液，測量蛋白濃度后取等量蛋白質(zhì)樣品(20微克/孔)，8%SDS－PAGE電泳，半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉后滴加兔抗人MMP－2/9抗體為第一抗體，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為第二抗體，ECL顯色，X線膠片曝光。

結(jié) 果

1．DiI－ac－LDL攝取特性:熒光顯微鏡下觀察到約 (85．6±4．9)%的細(xì)胞Dil－ ac － LDL吞噬試驗為陽性，此細(xì)胞為正在分化的EPCs［4］。胰腺癌細(xì)胞吞噬試驗陰性，見圖1。

圖1 內(nèi)皮祖細(xì)胞Dil－ac－LDL吞噬試驗(×400)

2．VEGFR－2、Ⅷ因子和 CD34免疫組化結(jié)果:用免疫細(xì)胞染色法對細(xì)胞染色后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面相關(guān)抗原VEGFR－2、Ⅷ因子和 CD34表達(dá)均為陽性，此類細(xì)胞被認(rèn)為是正在分化的 EPCs(圖2)。胰腺癌PANC－1細(xì)胞各抗原表達(dá)均為陰性。

3．百里醌對體外EPCs增殖的影響:百里醌可顯著抑制EPCs增殖，呈濃度依賴性。EPCs經(jīng)不同濃度百里醌(10、20、40和80nmol/L)作用12h后，細(xì)胞存活率分別為 93．4%、76．3%、64.5% 和 42．3%(圖3);百里醌濃度高于10nmol/L開始顯著抑制EPCs增殖，有統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0．05);百里醌作用EPCs細(xì)胞12h 后 IC50為51．2nmol/L。

圖2 EPCs經(jīng)VEGFR－2、Ⅷ因子和 CD34細(xì)胞免疫組化染色后倒置顯微鏡下觀察(×200)A．VEGFR －2;B．Ⅷ;C．CD34

圖3 CCK－8法檢測不同濃度百里醌對EPCs增殖的影響

4．百里醌對體外EPCs侵襲的抑制作用:百里醌對體外EPCs侵襲有抑制作用，呈濃度依賴性(圖4)。百里醌(10、20、40和80nmol/L)處理 EPCs 12 h后每高倍鏡(×200)下侵襲細(xì)胞數(shù)分別為31．1±3．8、18．1 ± 2．6 和 15．3 ± 2．3，與對照組(34．3 ±5.3)相比較，10nmol/L百里醌不能顯著抑制EPCs的侵襲行為(P＞0．05);而百里醌(20～80nmol/L)可顯著抑制EPCs體外侵襲，有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。

5．百里醌對EPCs體外血管生成的抑制作用:百里醌作用EPCs后，不僅小管數(shù)目減少，而且管腔不完整。不同濃度百里醌(10、20、40和80nmol/L)作用 EPCs 12h后，倒置顯微鏡下觀察，每高倍鏡(200×)下小管生成數(shù)為 37．8 ±5．8、23．4 ±4．9、19.1 ±3．4 和17．3 ±3．8，與對照組(51．6 ±7．8)相比較，均有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0．05)。

6．百里醌對 EPCs中MMP－2和MMP－9表達(dá)的影響:Western blotting結(jié)果表明，低濃度(10nmol/L)百里醌對EPCs中MMP－2蛋白表達(dá)無明顯影響，但高濃度(20nmol/L)的百里醌開始顯著下調(diào)MMP－2在EPCs中的表達(dá);百里醌(10～20nmol/L)可明顯抑制EPCs中MMP－9的表達(dá)，以20nmol/L百里醌抑制作用最明顯(圖6)。

圖6 不同濃度的百里醌作用EPCs 12h后，對MMP－2和MMP－9蛋白表達(dá)的影響，以β－actin為內(nèi)參

討 論

新生血管形成是由一系列步驟組成的生物學(xué)過程，包括內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移、血管管腔的形成與存活［4，5］。在健康成人中，內(nèi)皮細(xì)胞一般處于休眠狀態(tài)，新生血管形成在傷口愈合、炎癥反應(yīng)和月經(jīng)等生理過程中被嚴(yán)格限制著。而在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中，新生血管形成扮演著極為重要的角色，一旦腫瘤擁有誘導(dǎo)血管生長的能力，腫瘤生長就變得極富有侵犯性，從而為腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移提供便利和可能。因此，抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和功能體現(xiàn)，可有效抑制腫瘤中血管新生。有研究表明百里醌可有效抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)增殖及其功能，從而在其抑制前列腺癌生長中發(fā)揮了一定的作用，且沒有細(xì)胞毒性，表明百里醌具有一定的抗血管生成的作用［3，6］。

EPCs是一群能增殖分化為成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞，并參與內(nèi)皮損傷修復(fù)和出生后血管新生的前體細(xì)胞。內(nèi)皮損傷后的修復(fù)過程除了相鄰成熟內(nèi)皮細(xì)胞延展修復(fù)外，還有一部分是通過外周血中的EPCs分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞完成的［7］;同時在腫瘤血管新生過程中，EPCs從骨髓等組織中被動員至外周血液中，進(jìn)而增殖和分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞，從而在腫瘤生長的早期起到至關(guān)重要的作用，表明EPCs在血管形成的發(fā)生和發(fā)展中扮演了重要角色［8］。在本研究中，筆者成功培養(yǎng)出人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞，并經(jīng)DiI－ac－LDL吞噬試驗證實細(xì)胞的內(nèi)皮屬性，而VEGFR－2、VIII因子和CD34細(xì)胞免疫組化也進(jìn)一步證實了細(xì)胞的內(nèi)皮屬性。同時體外實驗表明百里醌可顯著抑制EPCs增殖，初步表明百里醌有抑制EPCs參與的血管生成的作用，與文獻(xiàn)報道相近［3］。

惡性腫瘤可動員包括EPCs在內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞至血管新生部位，這是一個多因素、多步驟的生物學(xué)過程。在動員過程中，EPCs穿過細(xì)胞外基質(zhì)至血管新生灶是動員過程的重要環(huán)節(jié)。EPCs侵襲的發(fā)生有賴于EPCs遷移能力的增強、不同時相細(xì)胞的黏附和解黏附、多種蛋白水解酶的表達(dá)及活性的增加從而降解細(xì)胞外基(ECM)［9］。而金屬蛋白酶家族(MMPs)在促進(jìn)細(xì)胞遷移和細(xì)胞外基質(zhì)降解等生物學(xué)行為過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，其中MMP－2在降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白中扮演著重要角色，從而在細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［10］。另外，在新生血管形成過程中，MMP－2在調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞管腔樣結(jié)構(gòu)形成過程中也發(fā)揮了一定作用［11］。因此，抑制MMP－2可顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞侵襲和血管形成［12］。在本研究中，高濃度百里醌可顯著抑制EPCs中MMP－2的表達(dá)，同時百里醌還能顯著抑制EPCs體外侵襲和小管形成，表明MMP－2在百里醌抑制EPCs功能體現(xiàn)中發(fā)揮了一定作用。而MMPs家族另一重要成員MMP－9可特異性降解被稱為細(xì)胞外基質(zhì)脊椎的Ⅳ型膠原，從而在促進(jìn)細(xì)胞侵襲和遷移中起到舉足輕重的作用;而抑制MMP－9可顯著抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移［13］;與此同時，MMP－9在人肝細(xì)胞癌中的表達(dá)水平還和腫瘤血管密度呈正相關(guān)，MMP－9的抑制劑還可顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，而抑制MMP－9可顯著抑制腫瘤誘導(dǎo)血管生長［14～16］。本研究中，筆者也觀察到低濃度百里醌即可明顯下調(diào)EPCs中MMP－9的表達(dá)水平，與本研究中觀察到的低濃度百里醌可顯著抑制EPCs侵襲和小管形成的實驗結(jié)果相符，從而表明百里醌可通過下調(diào)EPCs中MMP－9的水平從而抑制EPCs的功能體現(xiàn)，而百里醌有望作為新型的MMPs，特別是MMP－9的抑制劑應(yīng)用于臨床抗腫瘤治療。當(dāng)今，已有一系列MMPs的抑制劑作為抗癌和抗腫瘤的治療措施應(yīng)用到臨床試驗，并且收到滿意的療效［17］。因此，開發(fā)新穎低毒而更有效的MMPs抑制劑聯(lián)合傳統(tǒng)化療藥物有可能成為治療惡性腫瘤的新趨勢。

綜上所述，本次實驗結(jié)果表明百里醌可顯著抑制體外EPCs增殖、侵襲及小管形成，同時百里醌還能抑制MMP－2和MMP－9在EPCs中的表達(dá)，因此，筆者推斷百里醌可能通過其下調(diào)MMP－2和MMP－9的表達(dá)從而對EPCs增殖和功能產(chǎn)生抑制作用。從而為百里醌作為一種新型血管生成抑制劑應(yīng)用于臨床提供了一定的實驗參考。

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